课件：学术讲座免疫组化.pptVIP

* 染色前处理 脱蜡到水 抗原修复 内源性过氧化物酶阻断（简称阻断） 内源性生物素封闭（简称封闭） 内源性生物素 * （1）冰冻组织中存在内源性生物素。 （2）经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭。 （3）加热抗原修复可造成内源性生物素暴露。 （4）内源性生物素暴露的强度各不相同。 （5）内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布 也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中。 （6）内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺 上皮组织，亦存在部分非上皮组织。 （7）内源性生物素不仅存在人体组织，也存在大鼠组织。 （8）内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增 加依次为：柠檬酸、EDTA、EGTA。 （9）热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭。 * 1、进行内源性生物素封闭，并成为常规。 可采用蛋清或卵白素作为封闭剂。 2、或采用非生物素检测系统，如EnVision等。 3、应坚持使用阴性对照。 内源性biaotin去除 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 * 染色前处理 脱蜡到水 抗原修复 内源性过氧化物酶阻断（简称阻断） 内源性生物素封闭（简称封闭） 设置对照 阴性对照：缓冲液、免疫前血清、 吸收试验 明确没有被测抗原的组织 阳性对照：明确有被测抗原的组织 如转染某种质粒的细胞和没转染的细胞 * 染色---分步向组织片上滴加抗体 一抗、二抗、复合物 显色 Streptavidin Enzyme biotin 脊状分子 无生物素 * 一抗：鼠抗、兔抗 即用型、浓缩型、自制抗体 选择适当的稀释度（浓缩型、自制抗体） 一定要找到两个端点 稀释度恰当的标准： 最好的阳性显色和最低的背景 * 二抗及以后的试剂为试剂盒，浓度不要调整。但要决定用什么厂家、品牌的试剂盒。 试剂盒 抗兔、抗鼠、抗兔/鼠 什么工作原理 SABC、SP、 Envision 厂家：迈新（福州）、Dako等 * 时间和温度： 一抗 4℃过夜或室温1小时 其它 室温10-30分钟 注意点：用湿盒、组织不能干、 抗体覆盖组织、50ul/张 试剂4℃保存、PBS或TBS 显色 显色剂 * 辣根过氧化物酶 horseradish peroxidase，HRP 酶 DAB\AEC 底物 HRP的优点有以下几个方面 (1)体积小(分子质量40kDa)，不会遮盖抗原的结合部位，且穿透力强。 (3)具有较高活性及特异性。 (4)不溶性好，终产物不向周边扩散。 (5)组织中内源性酶较少，抑制方法较多。 ??? 催化过氧化氢分解而使其他氢供体氧化并生成水的一类酶。以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。 * 3，3’—二氨基联苯胺(DAB)为棕褐色 3—氨基—9—乙基卡巴唑(AEC)为红色 4—氯—1—苯酚(CN)为蓝色 DAB是广泛应用的电子供体，产物既不溶于水，又不溶于有机溶液，可长期保存。其终产物具有嗜锇性，经锇酸处理后电子密度增加，适用于电镜下观察。但DAB的缺点是具有潜在的致癌性，所以应尽量减少吸人和接触次数，并严格管理废液。 AEC室温下较稳定，产物不溶于水，但溶于有机溶剂，所以不能进行脱水等处理；又因其需用水溶性封固剂，时间长易褪色，限制了其应用。 * 显色的酶 底物 显示颜色 封片 辣根过氧化物酶 H2O2/DAB 棕色 中性树胶 H2O2/AEC 红色 甘油 碱性磷酸酶 NBT/BCIP 深蓝色 甘油 * 碱性磷酸酶Alkalinephos phatase AKP ?? 分子100kDa，穿透细胞组织的能力较弱。某些组织细胞内含有较高的内源性碱性磷酸酶， 对IHC染色会产生一定的干扰 。 AKP主要用于血涂片或骨髓涂片的白细胞相关检测。 AKP的呈色反应的敏感性要比HRP高2—3倍，显色时间可从30min到48h，可与HRP组合进行IHC的双重或多重标记。另外，内源性碱性磷酸酶可以在底物缓冲液中加入左旋咪唑(1evamisole)和镁离子(氯化镁)，或提高底物缓冲液的pH值，可以有效地消除内源