北师大版高中生物选修1生物技术实践微生物数量的测定.pptVIP

微生物数量的测定 饮用水、牛奶中细菌数的检测 平板菌落计数法 测定土壤中微生物数量 实验原理 平板菌落计数法是将待测样品按比例做一系列稀释之后，将其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的单个菌落，即一个单菌落应代表样品中的一个单细胞。 根据稀释倍数，取样接种量和菌落数即可换算出样品的含菌数。 1个菌落→1个活菌 操作步骤 1．制备尿素固体培养基 （依据技能卡) 操作步骤 2．取土样10g（10ml），放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的锥形瓶中，震摇20min，使土样与水充分混合，制成原液，将土壤（原液)制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的稀释液。 操作步骤 3．加样 取无菌平皿10套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6（稀释度）各3套，留一个平板作空白对照。分别用1ml无菌移液管 精确吸取10-4、10-5、10-6 3个稀释菌液各0.2mL，加至相应编号的无菌培养皿中。 操作步骤 4．倒平板 将菌液移入培养皿后立即倒入融化后冷却至45度左右尿素培养基（约15mL），置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀后，平治，待凝。 由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。 5．培养 待平板完全凝固后，倒置于恒温箱中37度培养。 6．计数 培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数。 统计原则 (1)选 30～300 个菌落的平板统计； (2)每个稀释度取3个平板取其平均值； (3)同稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大； (4)由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每克菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。 并按下列公式进行计算： 每克样品的菌数(Cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数/ 0.2/稀释倍数*10 7．结果 将培养后菌落计数结果填入下表： 统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此统计结果一般用菌落数表示。 每克样品中的菌株数=（C/V)* M*10 C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。 为什么？ 2、显微镜直接计数 优缺点 能分辨活菌 时间长，繁琐，测定值时常受各种因素影响。 由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞，所以，长成一个单菌落也可能来自样品中的2-3或更多个细胞。因此，平板菌落计数的结果往往偏低。 8．思考题 为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？ 要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？ 试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。 当平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？ 用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间（48h）后观察结果？ 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为 106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。 1、A同学筛选出150个菌落。 2、B同学筛选出50个菌落。 B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。 请你帮助A同学改进实验，提供具有说明了的证据。 设置对照—同等条件下，培养空白培养基 设置对照 设置对照的目的： 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 对照实验是指除了 被测试 的条件外，其他条件都 相同 的实验。满足该条件的称为 对照组，未满足该条件的称为 实验 组。 土壤，天然培养基，含有大量的微生物，其中70～90％是细菌。其次是放线菌和真菌。 确保平板上的