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基因工程药物制备技术 一、实验目的 通过本实验了解和掌握基因工程蛋白药物的发酵表达、提取、纯化及纯度检测等基本方法 三、实验器材 恒温震荡培养箱、超净工作台、天平、高速冷冻离心机、制冰机。、超声波细胞破碎仪、ompW 重组大肠杆菌、试剂、玻璃器皿等 四、实验内容 1、实验设计及菌种活化 实验整体设计方案的确定 培养基及溶液的配制 工程菌接种培养 配制溶液 每组试管、三角烧瓶培养基各一份；PBS全班2升； 培养基灭菌后加卡那霉素。 菌种活化 取菌种接种于10ml的LB培养基中（试管），37℃，190r/min摇床培养过夜。 溶液配方 1．LB培养基（1L） 蛋白胨 10g 酵母膏 5g NaCl 10g 用 NaOH溶液调pH至7.4，高压灭菌。 2．卡那/LB液体培养基中，按终浓度50μg/ml加入卡那霉素（母液浓度为0.25g/ml） 3．PBS（pH7.4）（1L） NaCL 8g KCL 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g 用 HCL调节溶液的pH至7.4，高压灭菌后，保存于室温。 2、 工程菌的发酵培养及诱导表达 实验内容 工程菌的发酵培养 诱导表达外源蛋白 离心收集菌体 配制液体 实验操作 1．摇瓶发酵表达 将试管中活化的菌种接入三角烧瓶，37℃，190r/min摇菌培养3～4小时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L（母液0.1mol/L），37℃诱导表达3-4小时。 2．菌体收集 诱导表达完毕后，4℃ 10000rpm离心10min，PBS缓冲液清洗一次后同样条件离心后再次收集菌体。-20℃保存备用。 3．配制包含体洗涤液（明天用） 包含体洗涤缓冲液I： 包含体洗涤缓冲液II： 包含体洗涤缓冲液III： 变性液（300mL) 变性液： 100ML Tris 1.2114g EDTA 0.0584g 2-硫苏糖醇 0.154 g 尿素 48.048g HCl 调至pH 7.5 3、破菌及包涵体的变性 实验内容 菌体的破碎 包涵体的分离 包涵体的洗涤 标准曲线的绘制 实验操作： （1）悬浮菌体：离心收集的菌体，用50毫升PBS（pH 7.4）悬浮菌体。 （2）超声破碎：冰浴条件下超声波裂解细菌，功率400W，5s/5s,直至溶液变为半透明。 （3）收集包涵体沉淀：10000rpm离心20min，弃上清，收集包涵体沉淀。 （4）包涵体的洗涤 沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液I，充分混匀。4℃，10000rpm，离心10min，弃去上清。 沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液II，充分混匀。4℃，10000rpm，离心10min，弃去上清。 沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液III，充分混匀。4℃，10000rpm，离心10min，弃去上清。 4、包涵体变性及复性 包涵体的变性 测变性液蛋白含量 复性 配制亲和层析缓冲液配制 （1）变性 将包涵体沉淀按5%（V/V）的稀释度用变性液悬浮，室温静置30分钟，10000rpm离心30min，留上清。 （2）用紫外吸收法测变性液蛋白含量 利用标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 （3）复性 将溶解后的蛋白质150 ug/ml稀释（100－200ug/ml），以PBS低温透析，换透析液一次，透析过夜。 洗脱缓冲液B NaH2PO4 6.00g NaCL 1.755g 咪唑 27.23 g 用高浓度NaOH调pH至8.0。 5、亲和层析及样品检测 亲和层析 用紫外分光光度计初步检测样品 亲和层析操作 （1）样品处理 透析液pH用高浓度NaOH调pH至8.0待上样。 （2）上样 将样品以滴管沿壁轻轻加到平衡好的Ni-IDA上。 （3）洗涤杂蛋白 以平衡缓冲液洗5个柱体积。 （4）洗脱 以咪唑洗脱液洗洗5个柱体积并收集洗脱液 （5）介质清洗 用10倍体积0.5M NaOH过柱，保证介质与NaOH溶液接触时间达到30分钟以上。 用10介质倍体积去离子水洗去层析柱中的碱液。 用5～10倍介质体积平衡缓冲液A平衡层析柱。 思考题： 1、发酵培养后加入IPTG的作用是什么 2、为什么要对包涵体进行洗涤？ 3、亲和层析液分光光度计检测结果分析 4、纯