基因构建一些知识.pptVIP

酶切、连接与质粒构建 何彰华 赢润生物技术 第一部分：限制性内切酶及酶切 1.1 限制性内切酶的简介 1.2 限制性内切酶的选择 1.3 常用酶切体系 1.4 酶切的应用 1.5 酶切常见问题及对策 1.1 限制性内切酶的简介 来源：原核生物。 限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的基本工具。限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。 回文序列与非回文序列 DraIII的识别顺序 酶切位点的查询 酶切位点的查询 同裂酶 来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同。 同序同切酶 同序异切酶 同尾酶 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能酶切产生相同的黏性末端。 1.2 限制性内切酶的选择 根据实验的目的 结合载体和基因的特性选择合适的酶切位点； 根据酶本身的属性 酶的酶切效率； 双酶切共用缓冲液； 选择何种公司的产品：Fermentas、TaKaRa、NEB。 1.3 常用酶切体系-双酶切 双酶切buffer 1.4 酶切的应用 构建质粒 鉴定 图谱 1.5 酶切常见问题及对策 Dam、Dcm和CpG甲基化 ① 如果DNA底物是从表达 Dam 或 Dcm 甲基化酶 的菌株中分离而得； ②且其甲基化识别位点与内切酶识别位点有重叠。 例如，从 dam+ E.coli 中分离的质粒 DNA 完全不能被识别序列为 GATC 的 MboI 所切割。 2）DNA切割不完全 A. 内切酶活性下降； B. 内切酶稀释不正确； C. DNA不纯，反应条件不佳； D. 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存 在其它修饰； E. 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性。 3）DNA片段数目多于理论值 A. 其它内切酶污染； B. 底物中含其它DNA杂质； C. 内切酶星号活性。 星号活性 在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。 第二部分：DNA的连接反应 2.1 连接酶 2.2 连接酶作用模式图 2.3 连接产物的形态 2.4 常用连接体系 2.5 连接产物的转化 2.1 连接酶 原理：催化两条双链DNA分子的互补粘性末端或平末端的5′磷酸基团与3′羟基形成磷酸酯键。 功能：将两条双链DNA片段连接起来，实现 DNA的体外重组。 注意：DNA连接酶催化平末端连接要比粘性末端 效率低得多。 2.2 连接酶作用模式图 2.2 连接酶作用模式图 2.3 连接产物的形态 2.3 连接产物的形态 2.4 常用连接体系 2.5 连接产物的转化 连接好的DNA产物可直接转化感受态细胞，用抗性平板筛选阳性克隆。 第三部分：质粒构建 目的基因进入原核或真核细胞并高效复制和表达蛋白质，需要装入表达载体才能实现。 作为基因工程表达载体所需具备的基本条件： A. 含复制起始，能自我复制； B. 带有抗性基因，便于筛选和鉴定； C. 有多克隆位点，便于重组操作； D. 带有强启动子。 3.1 重组质粒构建--粘性末端连接 Red同源重组 腺病毒重组 2011年7月 2011年7月 多克隆位点 抗性标记 T7 启动子 pET-28a：原核细胞表达质粒 2011年7月 复制起始 pcDNA3.1：真核细胞表达质粒 2011年7月 2011年7月 2011年7月 3.2 重组质粒构建--平末端连接 2011年7月 3.3 重组质粒构建--分步连接 2011年7月 3.4 重组质粒构建--连接、酶切、再连接 2011年7月 3.5 重组质粒构建--接头连接 2011年7月 3.6 重组质粒构建--同尾酶连接 构建多基因串联重组质粒 2011年7月 3.7 重组质粒构建--不依赖于酶切连接 LOGO WWW.YRBIO.COM 2011年7月23日 连接酶 作用模式 连接产物 连接体系 产物的转化 质粒载体 重组质粒构建策略 酶切 连接 质粒构建 2011年7月 本节讨论内容 内切酶的简介 内切酶的选择 常用酶切体系 酶切的应用 常见问题 2011年7月 2011年7月 限制性内切酶可分为三类 Yes 不特异，在识别位点下游 24-26 bp 5-7 bp 非对称 Ⅲ类 No 特异，在识别位点中或紧靠 4