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利用TAIL-PCR技术克隆南极磷虾胰蛋白酶 基因 摘要：目的研究南极磷虾胰蛋白酶基因的全序列， 为低温酶的基因工程制备建立基础。方法以南极磷虾基因 组DNA为模板，利用特异性的巢式引物和随机引物，通过交 错式热不对称 PCR ( Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction, TAIL-PCR) 克隆南极磷虾 胰蛋白酶基因序列，并进行序列分析。结果测序结果表明, 南极磷虾胰蛋白酶基因序列全长961bp,其中含有开放阅读 框(ORF)长度为798bp,编码266个氨基酸。结论本实验 成功克隆了南极磷虾胰蛋白酶基因，为进一步了解该酶的结 构、功能和基因工程制备奠定了基础。 关键词：南极磷虾；TAIL-PCR；胰蛋白酶；基因 胰蛋白酶是动物消化系统中主要的一种碱性蛋白水解 酶，属丝氨酸蛋白酶家族，能专一性地水解肽链中赖氨酸和 精氨酸的竣基所形成的肽键。南极磷虾因其独特的生活环 境，体内的胰蛋白酶具低温高效性，有研究表明，南极磷虾 胰蛋白酶在37匸和1?3￡时的活性分别是牛胰蛋白酶活性 的12倍和60倍［1］。深入研究该酶对适冷性酶酶学性质的 探究、蛋白质工程体系的完善具有极高的价值。目前获得南 极磷虾胰蛋白酶的方法主要是组织提取，这不仅步骤繁琐而 且成本高昂。本文旨在克隆南极磷虾胰蛋白酶基因，为进一 步在工程菌中表达以大量获得南极磷虾低温酶奠定基础。 交错式热不对称 PCR (Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction, TAIL-PCR)是一种快速有效 扩增已知DNA序列侧翼未知序列的方法［2-3］,由Liu和 Whittier ［4］首次报道该技术。目前许多基因的克隆都是通 过这个方法获得，马春骥等［5］用TAIL-PCR成功克隆了绵羊 肺炎支原体Y98株的未知基因Hsp70 (DnaK)，张伟涛等 ［6］利用TAIL-PCR克隆了一种耐盐基因。 1材料与方法 1. 1材料 南极磷虾冰冻样本2012年取自南冰洋水域 48. 1 区,限制性核酸内切酶 BamH I、EcoRV、PrimeSTAR Max DNA Polymerase^ Genome Walking Kit 购自 Takala 公司， pEASY-Blunt Cloning kit、pEASY-Tl Cloning Kit 购自全 式金公司，TIANamp Marine Animals DNA Kit购自天根生化 科技(北京)有限公司，DNA Engine Dyad PCR仪产自美国 Bio-RAD公司，PCR引物由北京华大基因公司合成。 1.2南极磷虾基因组DNA的提取 南极磷虾为本课题组参 加南极科考任务所取样品，取其尾节肌肉组织提取DNA,按 照动物组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行基因组DNA提 取。 1.3南极磷虾胰蛋白酶基因保守片段的克隆根据文献 及GenBank中已报道同源性较高的几种甲壳动物胰蛋白酶的 氨基酸序列，得到两条简并引物。上游引物： CCTTACCAGCTCAGCTTCCAG ； 下 游 引 物： TGCGGTGTTAGTCATAATCC。使用上述简并引物对基因组DNA进 行 PCR 扩增，反应体系：template DNA 200ng, primer 1 lOpmol, primer2 lOpmol, PrimeSTAR Max Premix (2X) 25 u 1, St erilized dis til led water to 50 u lo 反应条件: 98°C 10s, 55°C 5s, 72°C 5s, 35 个循环，72°C延伸 5min, 扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，将PCR产物用 QuickGel Extraction Kit 回收后 克隆至 pEASY^Blunt Cloning Vector,经酶切鉴定重组质粒测序。 1.4利用TAIL-PCR获得基因5端序列 根据克隆得到 的基因序列，利用Primer5. 0软件设计3条序列特异性的巢 式引物，SP1： GAGGAATGGCCTGGA CGAAGTCATT； SP2： CTCATGTTGGATGATCTTGGACAGG； SP3： AACACAATG TCCAGCGCAGATGGCo进行 TAIL-PCR 时，分别用 API Primer 和AP2 Primer进行反应，以AP2组为例，用上述提取的基 因组DNA作为模板，以AP2 Primer作为上游引物，以SP1 作为下游引物，进行1 stPCR反应。2st PCR反应将1st PCR 反应产物稀释1000倍，取1卩1作为2st PCR反应的模板， 以AP2 Prim