三、α-淀粉酶的分离提纯2010.pptVIP

* α-淀粉酶广泛分布于动物界（唾液、胰脏）、植物界（麦芽）和微生物界（枯草芽孢杆菌、黑曲霉、拟内孢霉）。 * 欲从较大体积的粗提取液中沉淀蛋白质时，往往使用固体硫酸铵 这是由于当固体硫酸铵加到水溶液中去时，会出现相当大的非线性体积变化，计算浓度相当麻烦，为了克服这一困难，经过测量，确定出1升纯水提高到不同浓度所需加入硫酸铵的量，实验数据以饱和浓度的百分数表示，使用时十分方便。 * * 生物技术专业系统实验（四）  酶（蛋白质）工程实验III __α-淀粉酶的分离提纯 * α-淀粉酶的分离提纯--硫铵盐分级沉淀及SDS分析 1.目的意义 2.实验原理 3.仪器设备 4.实验方法 5.实验报告 6.思考题 * 1.目的意义 目前市售α-淀粉酶大多数是粗酶，即还含有除α-淀粉酶外的其它蛋白质。 沉淀分离是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出，达到与其它溶质分离的目的。沉淀的方法很多，如，盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、复合沉淀、选择性变性沉淀等。 其中，使用最广泛的是盐析沉淀法。 在某一浓度的盐溶液中，不同的蛋白质和酶的溶解度各不相同，可达到彼此分离的目的。 通过硫酸铵盐析法能够将粗酶中的杂蛋白与α-淀粉酶分离开来，从而达到纯化α-淀粉酶的目的。 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS），根据粗酶中各种蛋白在电泳中的分子量大小差异显示α-淀粉酶的纯度。 * 2.实验原理 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当中性盐加入蛋白质溶液中时，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 * 盐析法沉淀法简称盐析法，是蛋白质和酶分离纯化中应用最早且至今仍在广泛使用的方法。蛋白质和酶在水溶液中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。在低盐浓度下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。而当盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质和酶的溶解度又随着盐浓度的升高而减少，结果使蛋白质和酶沉淀析出，这种现象称为盐析。 * 盐析　 一般是指溶液中加入无机盐类而使溶解的物质析出的过程。如：加入硫酸铵使蛋白质凝聚析出的过程。 * 固体硫酸铵加入法。加入之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，尤其到接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。  各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由硫酸铵饱和度表中查出。硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为百分饱和度，而不用实际的克数或克分子数。 * 影响盐析的因素 ① 蛋白质的浓度：中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当于25 mg/mL～30mg/mL。 ② pH值：蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。  ③ 温度：温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。 * 电泳 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。 不同的物质，由于其带电性质及颗粒大小和形状不同，在电场中他们移动方向和速度也不同，故此可使它们分离。 * 凝胶电泳 凝胶电泳是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。由于凝胶电泳同