荧光定量PCR、基因克隆与基因测序.pdfVIP

临床分子生物学 1. 试述荧光定量 PCR 技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用。 （1）原理：实时荧光定量PCR是一种将PCR扩增和扩增结果的检测有机地结合在一起的一种 分子生物学技术，系在PCR反应体系中加入能够反映PCR反应进程的荧光报告基团，随着PCR 反应的进行，荧光信号强度也按特定的规律随PCR产物不断累积而增加。同时，每经过一个 热循环，定量PCR仪收集一次荧光信号，通过实时监测反应体系荧光强度的变化来实时监测 PCR扩增过程，最终得到荧光强度随PCR循环数的变化曲线。理论上，PCR的扩增呈指数增 长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,其荧光量 与扩增产物量亦成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。最后根据该曲线的 特征及标准曲线实现起始模板数的精确定量。 荧光定量 PCR 的扩增曲线可以分为三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数增加 阶段和荧光信号平台期阶段。在荧光信号背景阶段，由于 PCR 扩增产生的荧光信号远远小 于荧光背景信号，为背景荧光所掩盖，我们难以判断产物量的变化。而在平台期，扩增产 物已经不再呈指数增加，PCR 的终产物量与起始模板之间没有线性关系，所以用终产物量 不能计算出起始模板的量。为了定量和比较的方便，在定量 PCR 中引入了三个非常重要的 概念：荧光基线、荧光阈值和 CT 值。基线是指 PCR 循环开始时，虽然荧光信号累积，但仍 在仪器可以检测的灵敏度下。基线范围的定义是从三个循环开始起到 CT 值前的第三个循环 止。荧光阈值的确定是 3－18 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。CT 值的定义是：每 个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。可见 CT 值取决于阈值，而阈值 取决于基线，基线取决于实验的质量，因此 CT 值是一个完全客观的参数。 （2）方法： 1、引物设计遵守的原则 2、探针设计遵守的原则 3、RNA 取 4、逆转录逆转录成 cDNA 5、常规 PCR 扩增 （1）反应体系 （2）混匀，瞬时离心。 （3）设定扩增条件，进行扩增反应，循环 35 次。 （5）产物用于琼脂糖电泳或-20℃长期保存。 6、 实时荧光定量 PCR 扩增目的基因 用假定初始拷贝数（X）的 cDNA 模板按 10 倍梯度进行稀释，制成标准模板系列，自每 个稀释模板中取样 5µl，分别加入 30µl 的反应体系中，行实时荧光定量 PCR。 反应体系在荧光定量 PCR 仪上进行，这种仪器较普通的 PCR 仪增加了一套复杂而紧密 的荧光强度检测系统及数据分析系统，可对 PCR 反应过程中的每一循环的系统荧光强度进 行实时（real-time）检测，通过对荧光强度的分析来达到等量检测的目的。 将 PCR 仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期。45 循环的扩增反应结束后， 系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数（DRn）进行分析绘制每一 反应管的扩增动力学曲线。根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈 值（threshold）时的扩增循环数 （Ct 值），根据 Ct 值与标准模板初始拷贝的对数值作 图，得到该样品的标准曲线。在此反应系统中，荧光强度的增加与模板量的增加成正比， 荧光强度的变化可反应模板产物量的变化。 7、基因相对拷贝数的检测与计算 8、统计学分析 （3）注意事项： A、在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套（经常替换）、一次性移液器吸头（带滤 嘴自卸式），并不能用手直接触摸毛细管、离心管的底部。 B、在试剂准备和标本处理时应使用超净工作台(负压式)或防污染罩，以防止对环境的污 染。 C、操作台、移液器、离心机、PCR 扩增仪等仪器设备应经常用 10%次氯酸或 75%乙醇擦拭 消毒。每次实验前后用 10%次氯酸和 70%乙醇擦拭移液器、操作台。 D、实验中涉及的有害有毒的标本及试剂应妥善放置，专人保管；废弃物应置专门容器中， 妥善处理。 E、荧光探针应避光保存，加入反应液中后，应尽快配制好反应体系进行扩增。 F、配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至 管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离 心数秒，避免产生气泡。