第八章哺乳动物基因工程.pptVIP

哺乳动物细胞的物理转化法 血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环 境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被细胞膜包裹的细胞 同时，外源DNA也容易进入。当上述外界条件消失后，红细胞膜又可 恢复原来的通透性。因此，可先将外源DNA转入血影细胞，然后再将 血影细胞介导法 核结构。在溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的 血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源DNA转入受 体细胞。 哺乳动物细胞的病毒转染法 以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒 共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导 入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围 有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。 E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白 8 哺乳动物基因工程 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体 利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂 利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII 生物工程专业核心课程 基 因 工 程 华东理工大学 张惠展 基因工程 5 2 3 4 1 6 7 8 9 基因工程的基本概念 基因工程的基本原理 基因工程所需的基本条件 基因工程的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建 大肠杆菌基因工程 酵母基因工程 哺乳动物基因工程 高等植物基因工程 D 高等哺乳动物的基因转移 8 哺乳动物基因工程 C 高等哺乳动物的载体系统 B 高等哺乳动物的受体系统 A 高等哺乳动物基因工程的基本概念 E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白 A 高等哺乳动物基因工程的基本概念 8 哺乳动物基因工程 高等哺乳动物基因工程 高等哺乳动物细胞基因表达技术 高等哺乳动物转基因技术 转基因动物个体 动物工程细胞 哺乳动物遗传性状改良 药物筛选研究评价模型 人体基因治疗 蛋白多肽物质大规模生产 药物筛选研究评价模型 B 高等哺乳动物的受体系统 8 哺乳动物基因工程 高等哺乳动物细胞的生长特性 高等哺乳动物受体细胞的条件 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 常用的高等哺乳动物受体细胞 高等哺乳动物细胞的生长特性 正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征： 锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂 血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长 接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制 形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构 上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代 且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞 会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状 态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。 高等哺乳动物受体细胞的条件 以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件 细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大 遗传稳定性 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存 合适的标记 便于转化株的筛选和维持 生长快且齐 分裂周期短，生长均一，便于控制 规模培养 大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能 安全性能好 不合成分泌致病物质，不致癌 满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 营养缺陷型的哺乳动物受体细胞 5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP） 次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP） 次黄嘌呤核苷（HR） GMP AMP 尿嘧啶核苷一磷酸（UMP） 胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP） 胸腺嘧啶核苷（TR） 嘌呤核苷酸生物合成途径 嘧啶核苷酸生物合成途径 次黄嘌呤磷酸 核糖转移酶 （HPRT） （TK） 胸腺嘧啶 核苷激酶 氨基喋呤（AP） 氨基喋呤（AP） 从头合成途径 补救合成途径 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 营养缺陷型的哺乳动物受体细胞 含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk -） 不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基 上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补 含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞 不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基 上（HAT培养基）生长，载体