低氧对水牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响-动物遗传育种与繁殖专业知毕业论文.docxVIP

P0．05)，而6．5％02组对COCs卵丘细胞扩展指数无显著影响(2．74 P0．05)，而6．5％02组对COCs卵丘细胞扩展指数无显著影响(2．74 vs 2．70， P0．05)。水牛COCs在5％02和20％02条件下体外成熟培养后进行体外 受精(In Vitro Fertilization，IⅦ)，获得的胚胎在20％02中体外培养，结 果发现：与常氧(20％02)组相比，COCs在低氧(5％02)条件下IVM组 能显著提高其IVF早期胚胎的8-cell分裂率和囊胚发育率(44．88％VS 38．47％，26．81％vs 15．60％，P0．05)。对HIFla和HIF2a进行免疫荧光 检测结果发现：在IVM前水牛COCs的卵丘细胞及在不同氧分压(5％02、 20％02)条件下IVM后的卵丘细胞上均有HIFla和HIF2a的表达；而在IVM 后的卵母细胞中HIFla均有表达，HIF2a几乎不表达。进一步进行实时荧 光定量PCR(Real．time Quantitative PCR，Q．PCR)分析，结果显示：在低 氧(5％02)环境中体外成熟培养水牛COCs，显著上调了COCs中卵丘细 胞HIFla、HIF2a、FSH的受体(FS腿)、IGFl的受体(IGFlR)、FOX01、 VEGF及其受体(ⅦGFRl、ⅦGFR2)、糖代谢相关基因(GIl丌1、LDHA、 G6DP)、热休克因子(HSP70、HSP90)和五聚环蛋白．3(Ptx3)的mRNA 水平(户O．05)，且显著下调了前列腺素内过氧化物合酶．2(Ptgs2)及凋 亡相关基因Bax和Bcl2的mRNA水平(PO．05)。TUNEL检测结果亦发 现，水牛COCs在低氧(5％02)中体外成熟培养，能显著降低其卵丘细胞 的凋亡率(21．84％VS 30．87％，P0．05)。 随后，探讨了低氧分压(5％02)体外培养水牛体外早期胚胎对其发育 能力的影响，并对低氧通路中HIF的调控路径及其通过无氧糖酵解影响水 牛早期胚胎发育的作用机制进行了初步研究。水牛COCs在5％02中IVM 后进行IVF，受精卵分别在不同氧分压(5％02、20％02)条件下进行IVC， II 万方数据 并收集囊胚，结果发现：低氧(5％02)IVC(M5C5)组的胚胎发育到2-cell、 并收集囊胚，结果发现：低氧(5％02)IVC(M5C5)组的胚胎发育到2-cell、 4-cell和8-cell的比率均显著高于常氧(20％02)IVC(M5C20)组(72．38％ VS 68．98％，62．32％vs 57．18％，49．65％vs 45．23％，P0．05)，但两组的囊 胚发育率差异不显著(27．24％vs 26．1 l％，P0．05)；免疫荧光分别检测两 组囊胚中HIFla和HIF2a的表达情况，结果表明：HIFla有表达，而HIF2a 几乎不表达；经Q-PCR分析发现：相对于M5C20组，M5C5组囊胚中HIFla 及调控其表达的相关基因(IGFlR、FOX01)、糖代谢相关基因(GLUTl、 LDHA、G6PD)、热休克因子(HSP70／90)和抗凋亡基因(Bcl2)的mRNA 水平显著上调(PO．05)，而促凋亡基因(Bax)的mRNA水平显著下调 (PO．05)。TUNEL检测结果亦发现，M5C5组囊胚细胞的凋亡率显著低 于M5C20组(3．89％VS 6．90％，P0．05)。 上述结果表明： (1)HIFla在水牛COCs的卵丘细胞和卵母细胞以及 囊胚中均有表达，而HIF2a仅在水牛COCs的卵丘细胞中有表达； (2)低 氧分压(5％02)条件有利于水牛COCs的体外成熟及其IVF早期胚胎的体 外发育；(3)在低氧分压(5％02)条件下，FSH和IGFl可能通过P13K／AKT 途径调节低氧通路的核转录因子HIFla稳定表达，稳定表达的HIFla可能 又通过促进无氧糖酵解有利于水牛卵丘细胞和早期胚胎适应低氧环境，促 进水牛卵丘细胞的扩展与增殖、上调发育相关基因的表达、抑制细胞的凋 亡，进而促进水牛卵母细胞的成熟，并提高其早期胚胎的发育潜力。 关键词：水牛卵母细胞 卵丘细胞早期胚胎低氧诱导因子糖酵解 III 万方数据 EFFECTS EFFECTS oF LoW oXYGEN TENSIoN oNⅥTRo M瞄口URATIoN AND EARI』Y EMBRYo DEVELoPMENT IN BUFIC剐Lo ABSTRACT In vitro maturation(IVM)of oocytes and in vitro culture(IVC)of early embryos are the key technologies for producing embryos