番茄花粉生殖细胞与音精细胞的分离纯化分析.docxVIP

University University Code：1 0225 Register Code：S 1 4509 煳燃Vo石西爿“X‘翼 Dissertation for the Degree of Master Isolation and purification of generative and sperm cells in tomato Candidate： Lu Yunlong Supervisor： Prof．Dai Shaojun Associate Supervisor： Prof．Wang Tai and A．E Wei Liqin Academic Degree Applied for： Master of Science Speciality： Cell Biology Date of Oral Examination： University： Northeast Forestry University 万方数据 摘要摘要 摘要 摘要 花粉(雄配子体)的发育涉及精细的调控机制，我们希望能通过高通量的组学技术 手段，在转录组、甲基组学等水平了解细胞分化前后的基因表达调控特征，以期进一步 了解雄配子体发育过程中，细胞功能分化和细胞命运决定的分子机制。获得大量高纯度 的生殖细胞和精细胞是首要前提，因此我们对大量分离生殖细胞和精细胞的试验进行了 探索。 我们以番茄花粉为实验材料，通过短时间(20分钟)体外萌发培养，使花粉管长度小 于花粉粒直径，再利用渗透压冲击法释放出位于花粉营养细胞细胞质内的生殖细胞，并 结合Pereoll密度梯度离心，对其进行大量分离纯化。又通过长时间(1 0小时)的体外萌发 培养，使生殖细胞在花粉管中完成分裂形成两个精细胞，再利用酶解法释放出花粉管中 的精细胞并结合Percoll密度梯度离心，完成了精细胞的大量纯化。应用上述方法分离生 殖细胞的产率约为2．8‰5．6％，细胞密度约为0．5×10 7～1×10 7个／mL，精细胞的产率约为 3．7％～5．5％，细胞密度约为1．0x10 7～1．5x10 7个／mL，并且FDA染色结果显示，分离细胞 的活性完好。我们还发现，萌发培养液中适宜的花粉密度是影响番茄花粉管生长状态的 重要因素；不含无机离子和缓冲剂的渗透液更利于使释放出的细胞质维持弥散状态；同 时，在常温下进行分离可能更有利于保持番茄花粉生殖细胞的生活力。这是首次大量分 离出具有细胞活性的番茄花粉生殖细胞和精细胞的案例，为接下来组学水平的研究提供 了可靠的材料保证，进而为研究雄配子体发育过程以及细胞功能分化奠定了基础。 关键词番茄：生殖细胞；精细胞；分离纯化 万方数据 AbstractAbstract Abstract Abstract The process of male gametophyte development is related to fine regulation．With the help of high throughput omic technology,we wish to leam more about the feature of the cells in each period of male gametophyte development at transcriptome and methy70me level in order to have a deeper knowledge of the molecular mechanism related to cell identity and cell differentiation．But the first and the most important step is getting large numbers of highly purified generative cells and sperm cells．For this purpose，we did some research to isolate generative cells and sperm cells in large scale． We chose tomato pollen as the experimental material．After germination cultivating／n vitro for 20min when germinated pollen grains had a pollen tube shorter than the diameter of the pollen grain，we successfully released generative cells by osmotic sho