番茄热只诱导型ftsh基因的分子克隆 表达特性及生理功能.docx

山东师范大学博士学位论文番茄热诱导型ftsH基因的分子克隆、表达特性及生理功能 山东师范大学博士学位论文 番茄热诱导型ftsH基因的分子克隆、表达特性及生理功能 (山东师范大学生命科学学院。济南，250014) 摘要 FtsH蛋白酶是一种兼具ATP酶活性、蛋白水解活性和分子伴侣活性的兼职蛋白，在 生物体内具有重要功能。原核生物中的FtsH蛋白酶多为胁迫诱导型；在高等植物中，FtsH 蛋白酶与光胁迫、低温以及病害等密切相关，但对其确切的作用机制尚不清楚。己在多 种原核生物中发现热诱导的加日基因，而在高等植物中尚未见热诱导胚硼报道。为此， 我们构建了热诱导的番茄cDNA文库，通过EST分析从中分离出全长的加上理砉因，将其命 名为LeftsH6。对其表达特性研究充分证明其热诱导表达特性；在此基础上，用反向PCR 法克隆了该基因的启动子，通过凝胶阻滞和GUS表达分析研究该基因的表达调控特征。 另外，我们构建-fLeftsH6基因的过量、胞质定位(无前导序列的LeflsH6eDNA)和反义 的真核表达载体并转化番茄，获得了各种转基因株系，以确定番茄热诱导型FtsH的生理 功能。 主要实验结果如下： 1．从热诱导的番茄eDNA文库中分离到全长廊珏基因并进行了特征分析。该基因序 列全长2213 bp(注册号：AB217916)，包括一个2019 bp的读码框，推测的蛋白前体定 位到叶绿体中，序列中存在AAA结构域和zn2+结合结构域等已知的金属蛋白酶FtsH家族 的特征结构域。在已克隆的基因中，该FtsH与拟南芥AtFtsH6最近源，被命名为LeftsH6。 利用农杆菌侵染的方法将含有三印栅信号肽编码序列和g彦的融合基因转化烟草，GFP 荧光表达分析发现：GFP在烟草表皮细胞的叶绿体中表达，证实LeftsH6基医]具有叶绿体 定位的特性。 体外蛋白酶活性分析表明，纯化的FtsH具有蛋白水解活性，能降解酪蛋白但不降解 BSA：突变的FtsH(Zn2+结合结构域中的谷氨酸Glu472突变为谷氨酰胺Gin)失去了体外 蛋白酶活性。Southem杂交结果表明，该基因在番茄基因组中是单拷贝；Northem和 Western杂交均表明该基因表达被热诱导，但其表达不被低温、干旱、盐胁迫、高光等胁 迫调节。本研究首次证明了高等植物中存在热诱导自啦赶基因。 2．用反向PCR法从番茄基因组中克隆了LeftsH6基因翻译起始位点上游1558 bp 的启动子序列(注册号：AB218274)，序列分析表明该启动子中除含有典型的TATA盒 和CAAT盒之外，还含有几组比较典型的热激元件(HSE)。利用原核诱导表达的热激 转录因子HsfA2和放射性标记的fisH启动子片段(包含HSE)进行凝胶阻滞实验，证 实LefisH6启动子中的HSE具有与热激转录因子特异结合的能力。 将LeftsH6启动子1558 bp、587 bp和332 bp的片段与gus报告基因融合构建真核 山东师范大学博士学位论文表达载体(pFl558、pF587、pF332)，转化烟草。对pFl558转基因烟草GUS活性检测 山东师范大学博士学位论文 表达载体(pFl558、pF587、pF332)，转化烟草。对pFl558转基因烟草GUS活性检测 表明，该启动子驱动GUS在热激的烟草根、叶片和花中高水平表达。各个发育时期花 的子房、柱头、花药和萼片，以及成熟花药的花粉粒均显示高水平的热诱导GUS染色。 启动子缺失分析表明，1558 bp的启动子介导的GUS热诱导表达是最强的；587 bp 的启动子区域能够介导GUS的热诱导表达，但明显弱于1558 bp启动子；而332 bD的 启动子片段驱动的GUS热诱导表达最弱。 GUS荧光定量分析表明：在转基因烟草叶片中，热诱导的GUS荧光活性在40℃达 到高峰，与Northern杂交结果一致。在相同的热激处理条件下，pFl558转化系显示出 最强的GUS活性，显著高于pF587和pF332转化系。实验结果充分表明，LefisH6是一 个典型的热激基因，其热诱导特性是通过LeftsH6启动子的HSE与热激转录因子的相互 作用介导的。 3．将LefisH6的全长cDNA序列构建到组成型启动子(CaMV 35S)控制的pROK2 真核表达载体中，转化农杆菌LBA4404，通过农杆菌介导的叶圆盘法转化番茄，获得了 过量表达LefisH6基因的转基因番茄，通过Southern杂交证实外源基因己整合入番茄基 因组，Northern杂交证实，外源fisH基因在常温条件下的番茄转基因株系中呈现组成型 表达，不同的转基因株系LeflsH6表达信号强度有差别。 过量转基因番茄营养生长正常，但生殖生长出现障碍。首先表现在花粉高度败育， 不能正常座果。通过RT-PCR／Southem杂