DNA测序技术简介 .ppt

计算机排序 5ˊ 非常规测序 毛细管电泳 用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳,节省时间,加快测序进程,其他程序同链终止法或化学测序法. 光点测序 脱氧三磷酸核苷酸连接到DNA 3’-末端时会释放1个焦磷酸(PPi) ,焦磷酸在磷酸化酶的作用下转化为化学能,并发出光亮.由此,往反应液中每次只加入1种核苷酸,当加入的核苷酸结合时,反应液发出亮点,并记录核苷酸种类;当核苷酸未结合时,反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此来测定DNA序列. DNA芯片测序 基本原理 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, 每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序. 利用基因芯片进行杂交测序的原理 序列的组装 随机测序与序列组装 随机测序也称”鸟枪法”. 序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸. 优点:不需预先了解任何基因组的情况. A B C A B C A B C A B C 小片段测序 计算机拼装 A B C 小片段测序 计算机拼装 鸟枪法(Shotgun)测序的问题 CAATGCATTA… …GCAGCCAATGC GAP 错装 实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装 超声波打断纯化的基因组DNA ↓ 琼脂糖电泳收集1.6～2.0Kb的区段、纯化 ↓ 构建到质粒载体中 ↓ 随机挑选19687个克隆,进行28643次测序,得到可读顺序为11 631 485 bp ↓ 组装成140个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群, ↓ 各重叠群间仍有间隙 顺序间隙 物理间隙 ↓ ↓ 载体或宿主菌 选用不当而被丢失的顺序 测序时遗漏的测序 解决办法:通过相邻已知顺序作为探针筛选已有的基因组文库 解决办法:利用其它宿主菌与载体重新构建文库 一、科学发展与社会需求之间的关系：HGP计划原定于2005年完成，而实际上到2003年就完成了，原因何在？ 二、分析化学的新发展： 分析化学正在向生命科学领域渗透。 ------金钦汉（吉林大学博士生导师） 三、DNA 测序的研究工作, 历经了数十年, 成绩辉煌, 曾两次获得诺贝尔奖。而后基因组的研究工作是更有意义且更具挑战性的，它必将激发科学家更大的创造力！ Shotgun测序 DNA整体 切成小段 小段和载体结合 进行扩增、测序 片段重叠排序 三 未来的测序技术 对现有技术的改进主要包括： (1)在自动测序仪内增加每块胶上的脉道数。 (2)改进软件分析系统，提高对增加泳道和延长DNA片段初始荧光数据的分析能力。 (3)采用新型凝胶电泳技术，提高条带的分辨率，扩展单反应数据范围。 (4)改进光学检测系统，开发新型荧光标记 ，提高检测的灵敏度，降低对模板数量及质量的要求。 (5)采用自动加样系统，提高加样质量和速度。 未来的测序技术主要包括： ★质谱法(mass spectrometry) ； ★杂交测序法(seguencing by hybridization,SBH)； ★单分子测序法(single-molecule seguencing) ； ★扫描隧道显微镜(atomic probe microscopy） ； ★超薄水平凝胶电泳技术(Horizontal Ultrathin Gel Electropho resis,HUGE) ； ★毛细管电泳法(capillary gel electrophoresis,CE ) ； ★芯片技术等。 《快速、简便的DNA 双循环测序法》 邓兵、王宁遂、朱静、张锦《中华血液学杂志》(1994.09) 《人类基因组研究——人类认识自身的跨世纪工程》 章彤、陈赛娟、陈竺