高效uv-致弱尾蚴开单链抗体库的构建及sjsca66-68kda scfv的筛选.docxVIP

硕士学位论文 硕士学位论文 中文摘要 中文摘要 研究目的 基于致弱尾蚴疫苗及天然分子疫苗高保护力的特点，利用噬菌体 抗体库技术诸多的优点，构建高效日本和血吸虫Uv-致弱尾蚴单链抗 体(ScFv)表达文库，并以此作为高通量的库源筛选出针对有潜在保 护力的天然分子抗原SjSCA66．68kDA的单链抗体，为进一步获取日 本血吸虫候选疫苗天然分子SjSCA66．68kDA的相关编码基因奠定基 础，加快抗日本血吸虫病高效天然分子基因疫苗研制的步伐。 研究方法 1．利用噬菌体展示技术构建高效日本血吸虫W照射致弱尾蚴单链 抗体库，并从库容量、多样性等方面对文库进行鉴定。利用W 照射日本血吸虫致弱尾蚴多次感染BALB／C小鼠，并将无菌W 致弱尾蚴血清，在正常尾蚴攻击感染(尾蚴数为40士2条)前以 及感染后一周，三周，共三次尾静脉注射转移至BALB／c小鼠体内， 45天后处死小鼠，分别计算减虫率和减卵率，确保其致弱尾蚴血 清的高效性。在成功构建致弱尾蚴小鼠模型的基础上，提取小鼠 脾脏RNA，用RT-PCR法扩增得到全套Ⅶ和vL基因，经重叠 PCR法扩增得到ScFv片段，将ScFv片段克隆至PCANTAB 5E 载体，电转化感受态TGl菌，经辅助噬菌体M13K07拯救，获得 的日本血吸虫W弱尾蚴单链抗体库。 2．利用建库时所获得的高效阱致弱尾蚴血清与日本血吸虫不同发 育阶段的抗原进行免疫反应，识别和选择免疫初筛的靶分子，并 对候选抗原SCA66．68天然分子免疫生化特性和序列的初步研究： 通过电泳切胶、电洗脱、超滤离心和冻干等方法分离和纯化 硕士学位论文 硕士学位论文 中文摘要 SCA66．68KDa抗原，用含SCA66．68KDa抗原PAGE胶结合微量 淋巴结注射法免疫新西兰兔制备出单特异性SCA66．68KDa免疫 兔血清，用ELISA和Western blot检测和鉴定其效价和特异性； 通过银染色和PAS染色确定SCA66．68KDa抗原的化学性质；用 N一端测序的方法研究SCA66．68KDa抗原的蛋白质序列。 3．运用分离纯化的疫苗候选分子SCA66．68kDa抗原，通过抗原直接 法和双抗体夹心法联合硝酸纤维膜富集法及菌落挖集法的组合策 略筛选高通量的阱照射致弱尾蚴单链抗体库，用Western blot 对所获得的特异性SCA66．68kDa单链抗体进行鉴定。 研究结果： 1．阱照射日本血吸虫致弱尾蚴血清被动转移BALB／c小鼠，可得到 42．5％减虫率，显著高于感染血清转移组的减虫率28．O％。在成 功构建W照射日本血吸虫致弱尾蚴小鼠模型的基础上，获得了 高效日本血吸虫W弱尾蚴单链抗体库，其的库容量测定为 1．9木108，重组率100％，多样性好。 2．实验发现，建库时的高效致弱尾蚴血清可识别血吸虫不同阶段抗 原的66．68kDa附近有共同的识别条带，加上本室先前的研究基 础，选择尾蚴66．68kDa天然分子作为免疫初筛的靶分子抗原。成 功分离纯化了电泳纯及免疫纯的SCA66．68kDa抗原，并成功制备 出单特异性SCA66．68KDa免疫兔血清，抗体效价高达1：12800； 硝酸银及PAS不同的染色方法来确定SCA66．68KD的化学性质为 一种蛋白类组分且是一种非糖蛋白；用N一测序的方法研究 SCA66．68KDa天然分子的蛋白序列，结果存在N．端肽段封闭现 象，提出了SCA66．68KDa天然分子的蛋白质测序的优化策略。 3．通过高效Uv_照射致弱尾蚴血清识别了SCA66．68kDa抗原，运用 分离纯化的日本血吸虫病疫苗候选分子SCA66．68kDa对呻照射 致弱尾蚴单链抗体库进行筛选。运用抗原直接法和双抗夹心硝酸 II 硕士学位论文 硕士学位论文 中文摘要 纤维膜法分别经过多轮淘洗富集，用集落挖掘法筛选致弱尾蚴单 链抗体库：双抗夹心法第一轮假阳性太高，复筛没有得到阳性克 隆；抗原直接法共获得6个SCA66．68kDa阳性克隆，将筛选获得 阳性克隆转化至Ecoli HB2151菌，诱导可溶性scFv表达。经 SDS．PAGE，Western blot分析，结果显示可溶性scFv获得了正确 表达，且与相应抗原SCA66．68kDa特异性结合。结果表明通过抗 原直接筛选法获得了特异性抗SCA66．68kDa单链抗体。 结论： 1．首次成功构建了高效日本血吸虫肼致弱尾蚴单链抗体库，它的 构建弥补了致弱疫苗应用的局限性，为开拓新的疫苗发展策略和 新疫苗的设计提供借鉴，也为进一步筛选用于血吸虫