课件：SSR分析的原理及操作技术报告.pptVIP

聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N,N,N,N’一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下，聚合形成线状长链，在交联剂如N,N-甲叉双丙烯酰胺参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的链与链之间交叉联接而形成三维带状网络结构的凝胶。 这些网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。 聚丙烯酰胺凝胶 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片断的分离与纯化。这些凝胶在尿素或甲酰胺等抑制核酸碱基配对的试剂的存在下发生聚合。变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。双链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率通常与其大小的常用对数值成反比。然而，电泳迁移率也受其碱基组成和序列的影响，因此，大小完全相同的两条DNA的迁移率可相差10％。非变性聚丙烯酰胺凝胶主要用于制备高纯度的DNA片段和检测蛋白质－DNA复合物。? 用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测时，通常PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离效果优于非变性胶。因为杂合个体在PCR后期的循环中会产生异源双链分子，导致在杂合的情况下胶中产生了3条带甚至是4条带，而不是正常的2条带。这种情况出现会干扰等位基因的统计。 染色方法与原理 溴化乙锭（EB）染色法：但是聚丙烯酰胺对荧光燃料溴化乙锭的荧光有猝灭作用，EB染色法很难检测到少于10ng的DNA条带。 银染法（硝酸银）：是一种检测微量DNA的理想方法。 优点：经济、简便、快速、灵敏，无污染、分辨率高、结果可永久保存 原理：银染液中的银离子(Ag+)可与DNA形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛在碱性条件下使Ag+还原成银颗粒，可把DNA电泳带染色成黑褐色 载样缓冲液（loading buffer） 指示剂（溴酚蓝或二甲苯氰）一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400等组成载样缓冲液，加入到扩增好的PCR产物当中。 作用： 1.增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 2.形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 3.使样品呈色，使加样操作更方便。 实验方法与步骤 1.实验材料 马贵荔（母本）×焦核三月红（父本）F1杂种群体中部分个体的基因组DNA溶液。每人做4个模板。 一对特异引物： B-F09 F：5’TCTGCTTACCAGCATGAGTGA 3’ B-F09 R：5’CTGTTGGTCTGCAGGTTTTG 3’ 2.配制SSR扩增的反应液： 各组份的用量及终浓度如下表，做多个反应时，可将所用的的相同组份一次取样、混匀后再分装至各个反应中。 组分 1个反应体积 终浓度 4个反应体积 ddH2O 10.2μL 40.8μL 10×buffer缓冲液 （含15mM Mg＋） 2.0μL 1× 8μL 2.5mM dNTP 1.6μL 0.2mM 6.4μL 5μM 引物F 1.0μL 0.25μM 4μL 5μM 引物R 1.0μL 0.25μM 4μL 模板DNA（5ng/μL） 4μL 1ng/μL Taq酶（5U/μL） 0.2μL 1U 0.8μL 总体积 20μL 80μL 3.SSR-PCR 配制好反应液后，放入PCR仪中进行扩增反应，扩增程序为： 94℃ 3min（预变性）； 94℃ 50s→55℃ 50s→72℃50s（35个循环）； 72℃ 10min（延伸反应） 4.制备5％的变性聚丙烯酰胺凝胶： 将长、短玻璃板固定在制胶板上，用1.0％的琼脂糖封口，将配好的胶溶液沿玻璃板点样端小心灌入，排除气泡，待胶灌满后插入梳子，静置1h，让其聚合凝固。 5％变性胶 100ml 尿素 （Urea） 42g 5×TBE buffer 20ml 40％丙稀酰胺 12.5ml 10％过硫酸铵 400μl TEMED 87.5μl 40％丙稀酰胺溶液（19：1） 100ml 丙稀酰胺（Acrylamide） 38g 甲义-丙稀酰胺（Bis-Acrylamide） 2g 5.电泳样品的准备：在PCR产物中加入8μL的loading buffer混合，得到混合物，95℃加热3min，迅速置于冰上冷却，然后点样。 6.电泳：每个点样孔中，点加适量的混合物（4μL），每排梳孔中最左边的梳孔用于点加DNA Marker（分子量标记物），以便计算分子量，以300V电压进行恒压电泳，电泳液为0.5×TBE，待溴酚蓝条带泳动至胶板底端时停止电泳。 Loadingbuffer组分 用量 98％Formamide（甲酰胺） 49ml（100％） 10MmEDTA（pH8.0） 1ml（0.5M，pH8.0） 0.25％Bromophenol Blue（溴酚蓝） 0.125g 7.染色 步骤