甘菊nac基因的功能研们究及对露地菊花的遗传转化分析.docx

University University Code：1 0225 Register Code：B 1 4003 Dissertation for the Degree of Doctor Functional Analysis of NAC Transcription Factors genes frOm Chrysanthemum iavandulifofium and genetic mod ification of ‘niu971 7’ Candidate： Dong Fengli Supervisor： Prof．Zhou Yunwei Associate Supervisor： Academic Degree Applied for： Doctor of Science Speciality： Ornamental Plant and Horticulture Date of Oral Examination： June 8，2014 University： Northeast Forestry University 万方数据 摘要摘 摘要 摘 要 植物NAC转录因子是植物中所特有的一类转录因子，参与植物基因多种途径的表 达调控，在植物对外界的生物与非生物的胁迫应答中起到关键的调控作用。菊花是中国 传统名花，品种繁多，但在逆境如低温、干旱、盐碱等胁迫下，往往限制了其生长和观 赏价值。因此培育抗逆性强的菊花新品种非常必要，但由于复杂的遗传背景，使菊花的 抗逆性研究进展缓慢。甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium(Fisch．ex Trautv．)Makino] 是菊科菊属的二倍体植物，遗传背景简单，且具有较强的耐盐碱能力。本试验从甘菊中 分离了2个NAC转录因子基因的cDNA全长，并对该基因进行生物信息学分析与表达 模式分析，并转入拟南芥中对其功能进行分析，以此来探讨甘菊中NAC转录因子基因 的表达模式与功能，然后将该基因转入菊花品种 一露地菊‘纽9717’中，进一步研究甘菊 NAC基因的功能，以期能了解甘菊中NAC转录因子的作用机制及为培育抗逆性强的菊 花新品系提供理论基础。主要研究结果如下： 1．在课题组前期构建的甘菊转录组数据库中搜索NAC转录因子基因的ESTs，采 用RACE技术分别扩增得到全长为881bp和1188bp的甘菊NAC基因cDNA序列 ClNAC9和CINAC39；其中CINAC9具有一个65lbp的ORF，编码217个氨基酸残基； ClNAC39基因具有一个849bp的ORF，编码283个氨基酸。保守结构域检索及氨基酸 序列比对结果显示，这2个基因都具NAM结构域，是NAC转录因子家族的成员，其 中CINAC9基因属于SENU5亚家族；CINAC39基因属于NAP亚家族，二者都是疏水性 蛋白质。 2．采用qRT-PCR分析CINAC在不同非生物胁迫和激素处理的表达模式。结果表 明：CINAC9基因受高盐、干旱、热、ABA胁迫的诱导，不受冷及水杨酸胁迫诱导； ClNAC39基因受高盐、干旱、热、ABA及水杨酸的胁迫诱导，只不受冷诱导。从基因 表达量变化峰值上，czMC9基因相对表达量明显高于aM3c9。 3．构建植物表达载体pBll21一ClNAC9和pBll21．CINAC39，采用农杆菌介导方法转 化拟南芥(C01．0)，经卡那霉素抗性筛选及RT．PCR鉴定转基因阳性苗。在NaCl、 NaHC03及干旱三种胁迫下两种转基因植株在表型明显优于野生型；转基因植株的 MDA含量都低于野生型植株，SOD、POD活力都高于野生型植株。实时定量PCR分析 表明转aMC9及删C39基因的拟南芥能够响应盐碱和干旱的胁迫，诱导下游与胁 迫相关抗性基因表达，增强了转基因植株的抗逆性。同时转CINAC9基因的拟南芥在表 现及生理指标上都优于转CINAC39基因的拟南芥。 4．以露地菊‘纽9717’腋芽为外植体，建立其初始培养。通过研究各阶段影响再生 诸因素的作用，建立了露地菊‘纽9717’腋芽增殖和叶盘愈伤组织再生两种途径的再生体 系。腋芽增值系数达到3．2，愈伤组织诱导率达100％，分化率达92．％以上，生根率为 万方数据 东北林业大学博士学位论文100％，为露地菊‘纽9717’遗传转化建立的了高效稳定的叶盘再生体系。 东北林业大学博士学位论文 100％，为露地菊‘纽9717’遗传转化建立的了高效稳定的叶盘再生体系。 5．通过根癌农杆菌介导，建立了高效的露地菊‘纽9717’遗传转化体系：卡那霉素 浓度10mg／L为叶片最佳的抗生素筛选浓度、8mg／L为转化苗生根的最佳选择压力；叶 片预培养时间为2—3d；菌液浓度为OD600为0．6左右；侵染时间为15min或OD600为O．8 侵染