高效合成udp-n-来glcnac多酶体系的构建.docxVIP

浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 摘要 摘要 UDP．N．乙酰葡糖胺是生物体内重要的活性核苷糖，可被大量用于寡糖的生 产，进而被开发成医药品或功能性材料。但由于其生产方法的限制，目前其供应 量仍较小，价格也很高。因此，本工作的首要目的就是找到一条低成本、高效率 的UDP．GIcNAc合成方法。 本文首先构建了三个带有His6标签的表达载体pET28-yqgR(葡萄糖激酶)、 pET28一agml(磷酸乙酰葡糖胺异构酶)和pET28-glmU(1-磷酸-N-乙酰葡糖胺焦 磷酸化酶)，并以Rosetta(DE3)]亨宿主茵实现了过量表达。利用干酵母和上述三 个蛋白构成的多步酶催化反应体系，能够以GIcNAe和UMP为底物合成 UDP．GlcNAe，其中干酵母的作用是将UMP生成U讦。经过对合成反应底物浓 度、反应温度、反应时间等条件的优化，50 mM GlcNAc和50 mM UMP在20。C 下反应72 h后，能得到31．5 mM的UDP．GIcNAc。 相比于体内表达三个酶蛋白，运用无细胞蛋白合成体系则显得更方便、快速。 故研究在无细胞蛋白合成体系中重建这三酶反应组成的UDP．GlcNAc生物合成 途径。文中构建了六个用于无细胞体系表达的带有His6标签的表达载体 plVEX2．4c—yqgR、plVEX2．4c—agml、plVEX2．4c—glmU和pSJ2一yqgR、pSJ2-agrnl、 pSJ2．glmU。将三个酶分别用无细胞体系表达后再进行合成反应，40 mM GIcNAc 在20*(2下反应24h后，生成4．1 mM的UDP。GIcNAc。用同一无细胞反应体系进 行三酶的共表达，表达产物用于合成产物，在相同反应条件下生成1．9 mM的 UDP．GIcNAc。试验结果表明无细胞体系能实现多个蛋白的功能性共表达，并重 建UDP．GlcNAc合成途径，进而说明它能成为一个重建代谢途径和小代谢网络 的理想研究体系。 关键词：UDP-N．乙酰葡糖胺，葡萄糖激酶，磷酸乙酰葡糖胺异构酶，1．磷酸-N． 乙酰葡糖胺焦磷酸化酶，无细胞蛋白质合成体系 VI 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 摘要 Abstract Uridine 5-diphospho N-acetylglucosamine(UDP-GIcNAc)，an activated nucleotide sugar,plays an important role in the biochemistry of all living organisms．And it is all essential substrate in the synthesis of oligosaccharides，which possesses high potential t0 be developed into pharmaceuticals and functional materials．However,due to the lack of an efficient method to synthesize this product，UDP-GlcNAc is in great demand and its price is notoriously high．Therefore，the aim of this work was to develop an efficient method to produce UDP—GIcNAc at low cost． Firstly,three recombinant Hiss-tagged plasmids were constructed，pET28-yqgR (Glucokinase)，pET28一agml fN-acetylglucosamine—phosphate mutase) and pET28·glmU fN—acetylglucosamine一1一phosphate uridyltransferase)，and transformed in