13第13章免疫组织化学技术.ppt

应用： 细胞表面成份的研究 胶体金技术与冷冻蚀刻技术结合-细胞膜蛋白颗粒或其它膜成份进行精细定位 电镜原位杂交技术，能够在超微水平上精确定出基因位点 免疫胶体铁细胞化学染色法 胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。 酶免疫电镜技术 酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。 第六节 免疫组化技术的应用 一、免疫组织化学技术的临床应用 荧光免疫组织化学技术的应用 自身抗体的检测 游离在外周血中的抗体 固定在组织中的的抗体 HEP-2细胞抗着丝粒抗体的阳性显色 肾小球抗基底膜抗体的阳性显色 细菌、病毒的快速鉴定 藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 寄生虫的检测与研究 猴胚肾细胞内弓形虫繁殖 吖啶橙染色 绿色-DNA 红色-RNA 恶变组织中肿 瘤抗原的检测 人肝癌细胞吖啶橙染色 其他：免疫荧光技术也应用于血液中B细胞和T细胞及其亚群的鉴定、特殊染色体的鉴定、激素和酶的局部组织定位等方面。 酶免疫组织化学技术的应用 提高病理诊断准确性（HE可观察到炎性细胞浸润，ED1染色可观察到巨噬细胞浸润） Survivin在肝癌细胞核的表达 癌基因蛋白的临床应用 对肿瘤细胞增生程 度的评价 Ki67在小肝癌组织中的表达 肿瘤转移 分期判断 肿瘤的靶向治疗 辅助诊断免疫性疾病 和感染性疾病，观察免疫复合物沉积状况 二、免疫组织化学技术的拓展 荧光激活细胞分类仪（FACS） FACS是将免疫荧光与细胞生物学、流体力学、激光和微机信息处理系统等多学科的高新技术融为一体，进行细胞和分子水平的基础理论与应用研究的一种先进仪器 FACS原理示意图 488 nm laser + - Fluorescence Activated Cell Sorting Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Sensor Fluorescence detector 共聚焦显微镜技术的应用 “ 细 胞 CT ”！ 激光扫描共聚焦显微镜 (Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM) 工 作 原 理 共轭光路使非焦平面的光线被抑制，减少了干扰，以及使用光色较纯的激光，所以成像分辨率更高增加了激光扫描部分，可连续、固定范围内小功率扫描，记录动态变化光学结构为共轭聚焦结构，此结构可使样品中间固定层面被激光扫描，通过调节参数可实现样品的多层扫描，俗称“细胞CT” 一般荧光显微镜（左）与激光共聚焦显微镜（右）的区别 LSCM 应用广泛 罗丹明123染细胞线粒体 细胞器研究-籍特异性荧光探针。图像清晰，可动态观察活细胞 鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝 检测人类癌细胞表皮生长因子 肿瘤细胞间通讯研究 分层扫描、光学切片 X Y Z X Y Z 焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图 细胞测量 细胞“CT”片 分层扫描、 光学切片 较厚层面 较薄层面 人血管内皮细胞PI标记观测损伤，标记细胞为损伤细胞 较厚层面 (平滑肌损伤可见) 较薄层面 兔动脉血管内皮细胞PI标记观测损伤，标记细胞为损伤细胞 三维重建-生物结构分析 植 物 切 片 三 维 重 建 免疫荧光 定量、定 位测量 随机圈取细胞可得到所圈细胞的相对荧光强度值 细胞内离子测定 细胞胞浆胞核同时动态测量Ca离子 胞核 胞浆 细胞膜流动性测定 其他：随着新软件的不断开发及各个学科的不短发展和相互渗透，LSCM还将会有更广阔的发展前景，并将生命科学的基础研究引向深入。 三、显微切割技术 显微切割技术是在显微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织,细胞，细胞内组分等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术 。 根据研究的需要可在显微切割前应用免疫组织化学、原位杂交等方法对需要切割的组织内成分进行标记。 显微切割仪 思考题 免疫组织化学技术有几个主要步骤？ 免疫组织化学技术操作中的主要注意事项？ 何为直接法、间接法、补体结合法荧光免疫组化技术？其各自优缺点如何？ 何为直接法、间接法、酶免组化技术？其各自优缺点如何？ 何为酶桥法、PAP、APPAP法技术？其各自优缺点如何？ 何为生物素－亲合素法？常用的技术类型及特点如何？ 何为葡萄球菌A蛋白法、凝集素法、链霉生物素－亲合素法？ 何为免疫电镜技术的原理？胶体金技术特点如何？ 免疫组织化学技术的临床应用如何？ 共聚焦