DNA体外重组技术介绍.pptVIP

第五章;概述;DNA克隆(DNA cloning); “克隆”某一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子－嵌合DNA，所以DNA克隆又称重组DNA (recombinant DNA)。;二、DNA重组技术基本程序;三、DNA重组的基本步骤;第一节; 作为基因工程载体所需具备的基本条件：;（一）按功能分类; ;基因克隆的质粒载体具备的特点：;抗药基因或营养代谢基因;Ampr;Ampr;pUC18/pUC19;pcDNA3：真核细胞表达质粒;（二） ?噬菌体; ?噬菌体作为载体具有两个特点;（三）粘粒载体（cosmid);（四） 酵母人工染色体载体(YAC);第二节;一、限制性核酸内切酶(II型);(1). 产生平头末端(blunt end);一、限制性核酸内切酶;;;二、DNA聚合酶;二、DNA聚合酶I;二、DNA聚合酶I;4.反转录酶(Reverse Transcriptase, RT);2. DNA指导的DNA聚合酶活性；RNA酶H(3′→5′RNA外切酶)活性.;三、DNA连接酶(DNA ligase) ——基因工程的缝纫针;三、DNA连接酶(DNA ligase);四、其他修饰酶;催化DNA，RNA以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的 5′ 磷酸基团水解。;第三节 目的基因的获得和修饰 分;一、采用限制性内切酶酶切法直接分离目的基因;三、基因组文库或cDNA文库的构建和筛选; cDNA文库(cDNA library，C文库)用基因克隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组体的群体，每一重组子只含一种mRNA信息，这些重组子的总和包含某种生物的全部mRNA序列。; 本方法适用于氨基酸残基数目较少的蛋白基因。;第四节;一、PCR产物的克隆策略;定向克隆;Nde I;TA克隆定义 ;常规的克隆方法：;TA克隆方法(一步PCR克隆);（一）粘性末端连接法;（二）平头末端连接法;（三）人工接头法;（四）同聚物接尾法;第五节;宿主细胞：被导入重组分子的细胞;大肠杆菌的转化;感受态细胞competent cell;重组质粒的导入方法;基因导入装置(Bio-Rad);λ噬菌体转染受体细胞;体外包装;二、重组DNA分子的鉴定 ;（一）抗生素平板筛选实为插入失活法;Ampr;用PstI酶切;;插入失活筛选法(1’20’’);（二）X-gal筛选蓝/白筛选;Ampr; ;阳性克隆;α互补筛选法（2’37’’）;(三）酶切电泳鉴定;重组CK2α 亚基转化子的筛选 第2, 6, 8, 10, 11, 13号克隆是阳性克隆; 第1, 3, 4, 5, 7, 9, 12号是阴性克隆;重组CK2β 亚基转化子的筛选 第1,2,3,5,7,9,10,11,12,13号克隆是阳性克隆; 第4,6,8号是阴性克隆;1. λDNA/EcoR I+Hind Ⅲ 2. recombinant plasmid /Nde I+Hind III 3. recombinant plasmid /Hind III 4. pT7-7/ Hind III ;（四）序列分析;ABI PRISM 310型 DNA测序仪;PE 377型 DNA测序仪;PE 3700型DNA测序仪;克隆的人蛋白激酶 CK2αcDNA重组质粒中插入片段DNA测序结果;;（五）其他方法;覆盖 滤膜;菌落印迹杂交 (6’03’’);SDSpurified recombinant human CK2α subunit and its Western blot;SDSpurified recombinant human CK2 β subunit and its Western blot