第五章鱼精的利用自鱼精中提取DNA-Na.ppt

第五章 鱼精的利用 ;一、自鱼精中提取DNA-Na;DNA的制备历史： 在五十年代是Zamenhoff等用不同方法从生产牛肉膏的下脚料小牛胸腺中提取的，后来牛肉膏被蛋白胨取而代之。 人们开始不断地探寻新的生产原料和方法。/国外亲从各种微生物中分离制取过DNA，但由于原料来源不便，未能广泛采用。 1972年德国专利报告了鲱鱼精巢DNA的制备。;在我国，早在1958年，中国科学院、上海鱼品厂等就以黄鱼精巢为原料制取了DNA-Na。80年代前后，浙江水产学院分别由鲐鱼、蓝圆鲹、大黄鱼和马面的精巢中提取了DNA-Na，并对其制备工艺进行了成功的筛选研究。 ;（二）、原料;4、DNA与蛋白质之间的结合强度应该是较弱的，否则难以分离DNA与蛋白质，在用变性剂去蛋白质时，往往要重复多次主能把蛋白除尽。多年来的实践证明，除了犊牛胸腺外，水产品中，淡水鱼，鱼等精巢均是较理想的原料，其次为蓝圆、大黄鱼和马面鱼精巢。 根据上面四个原则，很自然地提出了对原料新鲜度的要求，因为新鲜的才不会被解聚。而要想达到DNA含量高的要求，则必须在适当的生长时期采集，并且要设法抑制Dnase的解聚活力。 ;（三）、DNA-Na提取工艺;酚与CHCL3-5%SDS复合法，是浙江水产学院在吸取国外各种方法长处的基础上，经筛选改进而提出的适合工业化生产的制备工艺，它具有产率高，质量稳定，操作方便，周期短，成本较低诸优点。 ;工艺流程 原料 → 匀浆 → 搅拌→ 酚法变性 → 静置 → 离心或过滤 → 用5%SDS与CHCL3作第二次变性 → 离心或过滤 → 析出DNANa纤维 → 洗涤 →真空干燥 → 产品检验→ 成品及其包装 ;操作要点： 1、原料处理 对新鱼或冻藏鱼精除去污物和结缔组织。 2、匀浆 以原料与高盐溶液（2MnaCL-0.015M柠檬酸三钠溶液）比为1:3加入高盐液，以12000r/min×1′45″匀浆。 3、第一次变性 以原料与酚饱和溶液比为1：0.8后加速离心（3200r/min×30′） ;4、第二次变性 取上述离心后的上清液稀释至20-30倍（以鱼精原料为基础程），加紧入其1/9体程（以20倍稀释时）的混合变性剂（5%SDS ，CHCL3=1：2），同时加入固体NaCL，使整个体系氯化钠浓度保持1M。搅拌变性1h后，静置6-12h，离心。 5、DNA-Na的析出、洗涤和干燥 将二次变性后所得的上清液，徐徐倾入1倍体积的95%乙醇中，用两个容器往复倾倒几次，纤维状的DNA-Na就析出，将析出的DNA-Na依次用95%的乙醇、丙酮和无水乙醇洗涤二次后，迅速用P2O5进行真空干燥。 ;（四）、5′-脱氧核酸的分离与精制 ;;2、酶解反应 取定量热变性DNA-Na 液，以0.1N HCL 调Ph5.0±0.1，72℃预热，加Ph5.0±0.1的0.2M HAL-Ma 液5%（v/v），加0.05M ZnCL2 0.028%( v/v),酶解时DNA-Na浓度为0.5%-0.1%,加酶液（1mgNAD-Na,酶活10u）,计时并始终维持72℃±0.5℃ 1.5h,煮沸10min终止酶反应，急冷至室温。过滤后，用5%氨水调pH8-9，再过滤后作上清液检验（用磺基水杨酸检查去沉淀程度）并作纸层析鉴定，余者低温贮藏待用。 ;3、离子交换柱层析分离 201×8柱（200-400目）按常规预处理并转成氨型，用5%氨水调pH8-9，装柱，抽去气泡、平衡。 洗脱时，用0.0018N（附近）HCL、0.0028N HCL，分别洗出dCMP和dAMP，后用pH6.0的0.036N NaCL洗脱Dtmp，最后用0.02N NaCL 洗脱Dtmp，最后用0.2N NaCL 和0.005 N HCL 溶液洗脱Dgmp ;4、炭柱处理 按常规用蒸馏水浸泡过夜，在1N，NaOH 中煮沸15min ,用蒸馏水洗至中性，再用1N HCL 煮沸15min，并用蒸馏水洗至pH3.0；装柱、平衡。每ml活化活性炭交换22mg Dnmp ,上样流速1.9-2.6ml/cm2min 最后洗脱用5%NH3H2O:45%H2O:50%的95%乙醇的混合物，流速0.2-0.4ml.cm2min 洗至OD260为0.55以下。;5、真空浓缩 （1）第一级真空浓缩 浓缩液的蒸馏瓶置于水浴锅中（45℃） 冷凝器 集液瓶 集液瓶 安全瓶 干燥器（两级） 安全瓶（带真空表） 真空泵。目的是除去氨水、酒精和部分水。 （2）第二级真空浓缩 将一级浓缩液快速离心，真空度740mmHg以上、温度50℃左右，转速3000r/min .然后蒸发去水分，其水分经干冰冷凝器，至干燥，安全瓶，最后经真空泵抽出，结果使物料由液态浓缩成粘稠状。 ; 然后对Dcmp，调至pH2