【生物技术】第五讲 (2)植物单细胞培养技术.ppt

植物单细胞培养技术 周口师范学院生命科学系 1 植物单细胞培养的意义 1.1 有利于观察细胞个体的分裂、分化、生长和繁殖情况； 1.2 有利于获得纯细胞系； 1.3 有利于进行细胞特性、细胞生长规律、细胞代谢过程及其调节控制规律等方面的研究； 1.4 有利于生物转化和天然化合物的生产。  2 植物单细胞的分离技术 2.1 从外植体直接分离单细胞 2.2 从愈伤组织分离单细胞 2.3 通过原生质体再生法获得单细胞 2.1 从外植体直接分离单细胞 外植体经过切割、捣碎或酶解，然后经过一定孔径的不锈钢筛网过滤，得到细胞悬浮液。 悬浮液中所含的完整细胞数量较少，但分散性好。 2.2 从愈伤组织分离单细胞 将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团和残渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。 为了增强分散效果，必要时可添加适量的果胶酶，使由果胶粘连在一起的细胞分开。 2.3 通过原生质体再生法获得单细胞 外植体、愈伤组织或细胞团经过纤维素酶和果胶酶等的作用，除去细胞壁而获得原生质体。 3 植物单细胞的培养方法 3.1 平板培养法（1960年，Bergman） 3.2 看护培养法（1954年，Muir ） 3.3 微室培养法（1960年，Jones） 单细胞来源： 要求：调整后的密度为植板细胞密度的2倍 调整方法：①如果密度过大，加入液体培养基进行稀释； ②如果密度小，通过低速离心使细胞沉降后，再加入适量液体培养基。 当细胞植板密度过高(104或105个/ml)，使用和在悬浮培养中或愈伤组织培养中成分相似的纯合成培养基 当细胞植板密度过小，细胞对培养基的要求就变得越加复杂 注意：要选择适合单细胞培养的培养基 ①当培养基凝固后，细胞能均匀的分布并固定在很薄一层(1mm)培养基中 ②在培养皿外对单细胞做标记，便于观察。 注意：培养期间对细胞频繁的镜检会对细胞的生 长产生有害作用，应尽量减少镜检次数。 选取生长良好的由单细胞形成的细胞团，可以获得由单细胞形成的细胞系。 初始植板细胞浓度对单细胞培养的影响 用平板法培养单细胞或原生质体时，常以植板效率来表示 。 植板效率=每个平板上形成的细胞团数/每个平板上接种的细胞总数×100% 如果在琼脂培养基或液体培养基中，植板细胞的初始密度为1 ×104或1 ×105个/ml，植板后由相邻细胞形成的细胞群落常混在一起。 如果降低植板密度或完全孤立地培养单细胞，则可避免这个问题。但是当低于临界密度时，细胞就不能分裂。 原因是什么？ 初始植板细胞浓度对单细胞培养的影响 原因： 植物细胞的生长繁殖需要一定浓度的某些内源化合物。 初始植板细胞浓度对单细胞培养的影响 可能的原因是： 1 愈伤组织的存在给单细胞传递了某些生物信息 2 愈伤组织为细胞的生长繁殖提供了某些物质条件 微室培养的优点： ①有利于对细胞特性的研究 ②有利于对单个细胞的生长、分裂、分化等情况进行全程跟踪研究。 小 结： 通过这一节课 的学习，我们要掌握的知识点： 1 植物单细胞的获得方法 2 植物单细胞的培养技术 作业： 1 简述植物单细胞平板培养操作过程 2 在进行植物单细胞培养时，细胞密度过大或过小会对培养结果产生什么影响？ * * * 原生质体 再生细胞壁 外植体 愈伤组织 单细胞悬浮液 愈伤组织 再生植株 酶解 1 单细胞悬浮液的制备 2 单细胞悬浮液的密度调整 3 固体培养基的配制 4 单细胞悬浮液与固体培养基等量混合 5 暗培养 6 继代培养 3.1 平板培养法 程 序： 1 单细胞悬浮液的制备 3.1 平板培养法 程 序： 外植体(叶肉细胞) 愈伤组织 原生质体 2 单细胞悬浮液的密度调整 3.1 平板培养法 程 序： 3