Western blot和ELISA的技术原理及操作步骤演示文稿.ppt

ELISA的操作注意事项 显色 显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。 比色 拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。 * 今天主要重点讲Western blot，因为实验室可能很多人都会在今后的实验中接触到，ELISA的话只是做一个简单的介绍，可能对于具体的操作步骤我不能做到完整的呈现，所以有什么问题大家可以在操作的时候具体交流 * A图展示的是Western blot的一种方法，直接法。B图展示的是western最常用的方法，间接法，下面对这两种方法进行详细的介绍 * 在Western Blot实验中直接法就是直接标记一抗，再用底物显色。如图中所示，带有特定标签的待测蛋白质和其他非特异性的蛋白质的混合物与固相载体结合，再直接用标记的一抗与待测蛋白质相互作用，再用底物显色，在膜上就会出现带有特定标签的待测蛋白质。该方法具有一些优点，例如……但是与间接法比较，也有一些明显的缺点，例如……我之前所做的实验，关于Hfq-BAP生物素化的检测就用的这种方法，带有BAP标签的Hfq经过生物素化的步骤，然后与固相载体结合，用辣根过氧化物酶标记的链亲合素作为一抗，链亲合素与生物素可以特异性结合，同时辣根过氧化物酶能够与底物发生显色反应，这样就可以检测Hfq-BAP融合蛋白是否已经被生物素化。 * Western Blot 间接法基本原理：首先利用SDS对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。然后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗特定IgG的抗体可以直接购买作为二抗，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。间接法具有以下优点……也有一定的缺点…… * 总得来说：Western Blot结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，甚至可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 * Western主要应用在对蛋白的研究上，包括目的蛋白的表达量分析，表达特性分析，与其他蛋白的互作，以及目的蛋白的组织定位。 * 下面我们要了解的就是Western blot详细的操作步骤：首先要进行蛋白质样品的制备，然后跟我们平时检测蛋白质的步骤一样，跑SDS胶，然后是关键的一步，也就是转膜，转膜这一步是最关键的，因为这一步直接影响到最终的结果，转膜之后的步骤是封闭，封闭的目的是将膜上无蛋白的空隙用BSA或奶粉填满，以免在孵育抗体的时候一抗二抗与膜上的空位结合，产生非特异条带或者是背景杂乱。 然后就是特异性抗体与待测蛋白质杂交，最后是底物显色。注意，在进行每一步操作时都要用洗涤液进行洗涤，短时间多次洗涤的效果较好。 * 再看一下示意图，有个比较直观的印象。第一步，是要将电泳分离的蛋白质固定于膜上，也就是转膜，经过漂洗和封闭之后进行一抗的孵育，让一抗有足够的时间与待测蛋白结合，经过洗涤后，再进行二抗的孵育，二抗是能够特异性与一抗结合并用特定的酶标记的抗体，在底物的存在下，标记的特定酶能够与底物作用，催化发生显色和发光。 * Western blot最关键的步骤就是转膜。毛细管印迹法这种方法转移效率低，通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质（10%-20%）。而电泳印迹可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到膜上。 * 根据需要选择适当的转膜仪和转移膜，本实验室的转膜仪是适用于湿法转膜的，至于转移膜，一般选用NC膜和PVDF膜，NC膜不用经过甲醇活化，可以直接使用，PVDF膜需要用甲醇活化，两种膜的效果都比较好。之前用尼龙膜的比较多，但是，效果不佳。 * 杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的