经验介绍Primer premier 5.0以及Winplas功能介绍.pptx

经验介绍Primer premier 5.0以及Winplas功能介绍;PCR的基本原理;PCR的基本步骤;1. 引物长度 大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用短的（16~18）引物较好；若产物长度大于5kb，则选用24个核苷酸的引物较好。 ;2. 引物GC含量 GC含量在40%-60%之间，以45-55%为宜。这可为有效退火提供足够热。;3. 引物Tm 引物所对应模板序列的Tm值至少要在55-80℃之间。;4. 引物3端 引物3末端和模板的碱基完全配对 引物3末端的末位碱基在很大程度上影响着Taq DNA聚合酶的延伸效率，引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，可能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T 考虑末端5个碱基的△G 引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应 引物3端要避开密码子的第三位（简并引物的设计） 密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率;5. 引物序列与模板序列组成的相似性 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高的则错误引发率高。;6. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。?（扩增基因组或者整个家族中的某个基因） DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对，各基因相同的序列就是该基因的保守区。;7. 引物自身不应存在互补序列。? 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。;8. 碱基要随机分布 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，否则会使引物在GC富集序列区错误引发。;9. 引物应具有特异性。? 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测???如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。;10. 引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。? △G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。;11. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。? 引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。?引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。;Primer premier 5.0简介;启动界面;基本信息;引物设计界面;;引物设计;;;;引物编辑;;酶切位点分析;酶切位点分析;Winplas功能介绍;1. 点击“文件”菜单中新建命令，出现MapView窗口，同时工具栏中的绘图命令显亮。 2. 点击“插入”菜单中的“空片断”命令 ;绘制质粒;加粗 ;;绘制质粒;绘制质粒;4.?标记限制酶切位点;质粒图像的保存;