雏鸡大肠杆菌的分离鉴定及耐药性试验终稿.docVIP

雏鸡大肠杆菌的分离鉴定及耐药性试验 王丽1，陈克研1，刘佳2，杜崇涛1，赵传博1，赵魁1，高巍1，高丰1* （1.吉林大学畜牧兽医学院, 长春　130062；2.长春市动物检疫站, 长春　130061） 摘要：本实验通过细菌检测、PCR鉴定、生化试验、血清型鉴定、动物回归试验等对长春市某鸡场送检的10只2日龄疑似大肠杆菌病死亡的雏鸡死亡病因进行系统地分析,初步判定为大肠杆菌致死。药敏试验分析结果表明，该菌株仅对复方新诺明、青霉素、链霉素等药物敏感，对丙氟哌酸、氨苄青霉素、左氟沙星等大多数抗菌药物高度耐药。经电镜负染观察及传代细胞系和鸡胚进行病毒分离，结果均为阴性。 关键词：雏鸡；大肠杆菌；分离鉴定；药敏试验 中国图书分类号：S852.612　　 文献标识码：A作者简介 作者简介:王丽(1988 - ) ,女,山东人,本科,主要从事动物病理解剖学研究。 *通讯作者：高丰，教授，博士生导师。 鸡大肠杆菌病(Avian colibacillosis)是由大肠埃希氏菌(Escherchia colibacilli, E. coli)的某些致病性血清型引起鸡的一种主要细菌性传染病，同时又是一种极为重要的胚胎性疾病[1]。鸡大肠杆菌病是近年来严重危害养鸡业的主要疾病之一。大肠杆菌病在哺乳动物主要引起肠道疾病，而在禽类，当宿主防御能力下降时，常引起继发性局部或全身性感染。主要引起感染禽的败血症、大肠杆菌性腹膜炎、心包炎、肝周炎、输卵管炎、脐炎、滑膜炎、气囊炎、肉芽肿、眼炎等多种病变[1-3]。2010年7月本试验从病原学和病理学角度对长春市某鸡场送检的10只死亡雏鸡的死亡原因进行了系统的分析，确诊雏鸡为大肠杆菌感染致死。此外，本研究对所分离菌株的耐药性进行了分析，为临床大肠杆菌病的诊断及防治提供了理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病料来源 长春市某鸡场送检的疑似大肠杆菌感染的10只2日龄海兰褐鸡，送检时已死亡12h。其主要症状为食欲不振、拉黄白色稀粪，经氟哌酸等药物治疗，疗效不佳，陆续死亡，发病率和死亡率均在10％左右。 1.1.2 主要试剂 麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、革兰氏染液、购自北京鼎国生物制剂有限公司；普通肉汤培养基、普通琼脂培养基、三糖铁琼脂、药敏片为本实验室自制；Taq DNA聚合酶、dNTP、标准分子量核酸DNA Marker DL-2000为TaKaRa公司产品；葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、枸橼酸盐及各类生化反应试剂等购自北京鼎国生物制剂有限公司。大肠埃希氏菌O型抗血清购自中国兽药监察所。 1.1.3 引物 参照文献中禽致病性大肠杆菌的毒力相关因子基因序列合成2对引物，由华大基因公司合成。大肠杆菌通用引物：上游5’-TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG-3’,下游5’-ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC-3’;大肠杆菌特异性引物：上游5’-CAGGTCGTCGTGTCTGCTAAA-3’ ，下游5’-TCAGCGTGGTTGGATCAACCT-3’;细菌通用引物：上游5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’?，下游5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。? 1.1.4 实验动物 3日龄健康海兰褐鸡30只，购自长春市农科院种鸡场。 1.2 方法 1.2.1 直接染色镜检 无菌采集病死鸡的心、肝、脾、肺、肾等组织，将病料触片和血液涂片，分别进行革兰氏染色和碱性美蓝染色，镜检。 1.2.2 细菌分离培养 将无菌采集的病料接种于普通肉汤中进行增菌培养，37℃培养24h后，取肉汤培养物分别划线于麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基及斜面培养基上进行培养，观察细菌生长及菌落特征，并作进一步鉴定。 1.2.3 PCR鉴定 应用本实验室合成的大肠杆菌通用引物、细菌通用引物及大肠杆菌特异性引物对分离的细菌进行PCR鉴定[4]。 1.2.4 生化试验 将分离的菌株接种于葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、枸橼酸盐等微量糖发酵管，37℃恒温培养18h～24h，观察结果。 1.2.5 血清型鉴定 采用大肠埃希氏菌标准O型抗血清与纯化菌株进行直接凝集试验。 1.2.6 动物回归实验 将分离鉴定的菌株接种到肉汤培养基上，37℃培养18～24h，将菌液颈部皮下接种20只3日龄海兰褐鸡，每只0.2ml（约2×108CFU）。并设10只为对照组，每只颈部皮下注射0.2ml灭菌肉汤。隔离饲养，观察一周。 1.2.7 药敏试验 无菌挑取大肠杆菌纯培养物，接种于肉汤培养液中进行增菌培养，24h后，蘸取培养液均匀涂布于普通琼脂培养基，37℃干燥8min。然后将呋喃妥因等23种抗生素纸片分别对称地置于培养基表面，每个平皿帖4种药敏纸片，37℃恒温18～20h后观察抑菌环大