地高辛标记的southern杂交.ppt

DNA转移的效率较难判断，只有在转膜结束后，通过EB染胶，及分子杂交才可以鉴别效率高低，但已无补救措施，因此，每一步应严格操作 转膜时间（duration of transfer，12hrs） 取决于毛细吸附系统 胶厚度(5mm)及浓度(1%) ＤＮＡ大小：ＤＮＡ分子量大小决定时间长短，部分去嘌呤减小ＤＮＡ，碱转２hrs大部分结合到膜。 尼龙膜（带正电荷的）具有较大的DNA结合容量，它能够吸附变性DNA，核酸能够不可逆结合在尼龙膜上。尼龙膜两边均有同样吸附DNA功能(无论用哪边均可以经久耐用，可反复利用10次以上次），经毛细吸附作用，把DNA从凝胶上转到膜上。DNA转到膜上是复制胶上的带型，再在80-100℃真空干燥2 hrs，即可固定DNA。 操作步骤 制胶：注意琼脂糖的质量，胶的浓度，厚度（5mm）及均一性。一般大电泳槽配制250ml 0.8%琼脂糖凝胶； 制样，点样：DNA样品中指示剂量稍多 电泳：一般1-1.5V/cm的电压， 使DNA迁移到适当距离，一般指示剂约移动10-11cm (大电泳槽：40V×12-15hrs，小电泳槽30V×4-5 hrs) （一）0.8%琼脂糖电泳 （二）转膜前的准备 每组2个合适大小的水盘 1根玻璃棒，1块铲胶板，1个切胶刀 2张搭盐桥的滤纸（13cm×35cm) 1张合适大小的尼龙膜(7cm×10cm) 2张比尼龙膜稍大的滤纸(7.5cm×10.5cm) 一叠5cm左右厚的吸水纸(8cm×11cm) 1大1小2块玻璃板 试剂：碱转移：0.4M NaOH, 0.2N HCl 盐转移：0.125M HCl; 1.5M NaCl/ 0.5M NaOH 1.5M NaCl/0.5M Tris; 20×SSC 盐转移 1 凝胶的预处理: 电泳槽中移出凝胶置于塑料板上，用切胶板把胶切成适当大小，切去右上角（最后一个样品的最前端）作为电泳方向记号 把凝胶翻面，放入加有足量的0.125M的 HCl玻璃盘中，轻轻摇动约10min，使电泳指示剂溴酚蓝变为黄色为止（脱嘌呤）。倒去HCl溶液，加蒸馏水漂洗凝胶 倒去蒸馏水，加入足量变性缓冲液（NaOH/NaCl）淹没凝胶，轻轻摇动变性30min。倒去变性缓冲液，加蒸馏水漂洗 倒去蒸馏水，加入足量的中和缓冲液（Tris/NaCl）淹没凝胶，轻轻摇动30min中和。倒去中和液，蒸馏水漂洗 20×SSC 中平衡10 min以上 2 另一玻璃盘中加入足量的转膜缓冲液(20×SSC)，放上洗净的玻璃板，用2-3张滤纸放在玻璃板上，两端浸入转膜液中搭制盐桥（注意滤纸之间不能有气泡） 3 在盐桥滤纸上洒些转膜液，立即将胶放在盐桥上（注意凝胶与盐桥之间不要有气泡），胶的四周用塑料片与胶紧紧相连，防止短路（即放置吸水纸与盐桥相接） 4 小心将膜覆盖在凝胶上（膜可以先用H2O浸湿，再放到20×SSC中平衡，膜与凝胶之间不要有气泡，要求一次成功，膜一旦贴到凝胶不能移动） 5 膜上放2张滤纸，滤纸上放不少于5cm厚的吸水纸，放上玻板，其上压约350g的重物，转膜过夜 转膜完毕，将膜小心取下，2×SSC 短暂漂息，用两张滤纸包住膜，置于真空干燥箱中， 80℃固定2 h或120℃ 30min 用EB染胶以检测转移效果 （四）烘膜 电泳时最好点上约5μl的地高辛标记的marker 电泳时DNA 的量不要过大，否则部分降解的DNA 片段就会与探针杂交引起背景很深 电泳时不要将EB 加到凝胶或缓冲液中 变性和中和步骤中的处理30min可以分成2×15min 任何时候操作尼龙膜时都要戴着无尘手套用镊子接触膜的边缘 转膜时严禁防短路，不要让吸水纸全部湿透，重物根据膜的大小从200g-500g 不等 面积较小的膜可直接放到胶上，如果尼龙膜较大，可以先在水中浸湿再放入20×SSC平衡， 转膜后2×SSC 短暂漂洗尼龙膜以免杂交时有背景 预杂交及杂交时保证buffer覆盖膜 如果尼龙膜要多次探测，务必保证在任何时候都不要让尼龙膜干燥 注意： 杂交 预热一定体积的DiG Easy Hyb（10ml/100cm2膜）至杂交温度37-42 oC 。 预杂交30分钟。在不加探针的情况下，仅将膜放在杂交液中42 oC下充分润湿。（此过程可以延长至数小时） 变性：Dig标记的探针（约25ng/ml）加50μl H2O置沸水浴或98 oC干浴锅中5分钟后迅速放在冰上冷却。（不能用碱变性！） 将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2）中，混匀，避免泡沫。 倒出预杂交液，加入探针和DIG Easy Hyb混合液。