第3章蛋白质通性、纯化与表征.pptVIP

第3章 蛋白质的通性、纯化和表征 一、?蛋白质的酸碱性质和等电点 二、?蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性。 1、?稳定蛋白质胶体溶液的主要因素： ①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开，不会互相碰撞凝聚而沉淀； ②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，构成稳定的双电层，互相排斥不致聚集沉淀。 2、??沉淀蛋白质的方法 ①盐析法: 大量的中性盐（（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl），使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀；不引起变性。 ②有机溶剂沉淀法： 破坏水化膜，降低介电常数，丙酮、乙醇等； ③重金属盐沉淀：pH＞pI时，蛋白质颗粒带负电荷，与重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀； ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于pI时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸； ⑤加热变性沉淀法。 三、蛋白质分离纯化的一般原则 纯化的实质：增加制品的纯度或比活性 一般程序：前处理、粗分级分离、细分级分离、结晶保存 1、前处理（pretreatment）： ①将组织和细胞破碎 动物组织和细胞：电动捣碎机 、匀浆器、超声波处理； 植物组织和细胞：石英砂+提取液研磨或用纤维素酶处理； 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖） ②如果所要蛋白质集中在某一细胞组分，用差速离心法收集细胞的某一组分（表7－5）； ③如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。 2、粗分级分离（rough fractionation) 一般用选择性沉淀法。 ①（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析） ②等电点选择性沉淀法 ③有机溶剂分级沉淀法 3、细分级分离（fine fractionation) ) ★层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC） ★电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳等）、等电聚焦、双向电泳 ★密度梯度离心 4、结晶（晶体保存） 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度 的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节pH。 四、?蛋白质的分离纯化方法 （一）根据分子大小的差异 透析法：将样品装在透析袋里，半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。 超过滤法：施以一定的压力强迫小分子物质通过半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子。 （二）根据溶解度差异的分离法 蛋白质的盐溶与盐析 盐溶：是指在适当的中性盐浓度溶液中，蛋白质溶解度会提高的现象，称盐溶。 盐析：向蛋白质溶液中加入大量中性盐（高盐浓度）时，会破坏蛋白质分子表面的水化层（即破坏了蛋白质在水溶液的稳定性因素）导致蛋白质的溶解度降低发生沉淀析出，称盐析。 常用的饱和硫酸铵沉淀法分离纯化蛋白质就是利用盐析的原理，不同的蛋白质对饱和硫酸铵的要求不同，所以，可以通过饱和硫酸铵的分级沉淀法分离各种蛋白质。 （三） 根据电荷性质的差异 1、电泳法 电泳：带电荷的蛋白质或核酸分子在电场中移动的现象称为电泳。 带正电荷向负极泳动，而带负电荷向正极泳动，分子量小的蛋白质泳动快，分子量大的泳动慢，于是蛋白质被分离。 影响因素 ①电荷、粒子的大小和溶液的粘度 ②电场强度 ③溶液的pH 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳 基本原理 ： 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，根据被分离物质所带电荷的多少、分子形状、分子大小的不同，在电场的作用下产生不同的移动速度而分离的方法。 聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂和加速剂的作用下聚合而成。网状的大小决定于单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度及两者的比例。 SDS(sodium dodecyl sulfate) 若果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS ，SDS是一种阴离子表面活性剂， 几乎能破坏蛋白质中所有的非共价键，从而使多亚基蛋白质解聚，并使多肽链呈伸展状态，消除了蛋白质形状对迁移率的影响； SDS能以1:2比例与肽链中的氨基酸残基结合，使变性蛋白质带上大量的净负电荷，多肽链上带的负电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别，结果所有的SDS—蛋白质复合物，电泳时都以几乎同样的电荷质量比向正极移动并具有相同的构象，所以同一电泳条件下，分子量成为决定