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5 细胞悬浮培养 5.8 植物细胞大规模培养及有用物质生产 （一） 概述 （二）植物细胞规模化培养体系的建立 （三）生物反应器的类型及特点 （四）利用细胞培养生产有用物质 （一） 概述 植物体中次生代谢物(Secondary metaboites)的产生和分布通常有种属、器官、组织和生长发育期的特异性，同时，受到环境中各种因素的影响。人们利用次生代谢产物作为药材、香料、化工及食品的历史十分悠久，在人类防病治病历史上，次生代谢物也一直发挥着重要作用。 随着对次生代谢产物了解的不断深入，其功能越来越多地被人们所了解，应用越来越广泛，人类对其需求量也越来越大。而野生植物中次生代谢物产量十分有限，因此，通过细胞大规模培养技术来生产植物次生代谢物受到广泛关注。 与其它的方法相比,应用植物细胞培养技术生产次生代谢产物具有以下优点: (1)能够保证产物在一个限定的生产系统中连续、均匀生产,不受病虫害、地理和季节等各种环境因素的影响; (2)可以在生物反应器中进行大规模培养,并通过控制环境条件得到超过整株植物产量的代谢产物; (3)所获得的产物可从培养体系内直接提取,并快速、高效的回收与利用,简化了分离与纯化的步骤; (4)有利于细胞筛选、生物转化,合成新的有效成分; (5)有利于研究植物的代谢途径,还可以利用某些基因工程手段探索与创造新的合成路线,得到价值更高的产品; (6)节省大量用于种植原料的农田,以便进行粮食作物的生产。 1、若干有用物质的生产: 如生物碱、苷类物质、醌类物质、蛋白质、食品添加剂、农药等。 2、存在的问题： 在植物细胞培养过程中普遍存在的细胞系不稳定、细胞生长缓慢、不耐剪切力及代谢物产量低等问题又成为其实现规模化生产的瓶颈 。 3、技术要求： 充分利用基因工程的手段，筛选高产细胞系（细胞遗传稳定，细胞生长和生物合成快，次生代谢产物易积累而不宜分解）、深入研究特定代谢产物的生物合成途径、对培养条件进行优化等等。 所以，研究和开发适合植物细胞培养的生物反应器是解决这些问题的根本途径。 （二）植物细胞规模化培养体系的建立 1、高产细胞系的选择 （1）准确选择生产目的化合物的植物种类 （2）尽量选择自然状态下产生天然产物的 组织器官作为外植体 （3）高产种子细胞克隆的方法 先建立单细胞培养 ，产生愈伤组织，一份进行含量测定，一份保留培养。 2、种子细胞系的增殖与放大培养 3、大规模生产体系的建立 分批培养 连续培养 半连续培养 （三）生物反应器的类型及特点 1、机械搅拌式培养系统 2、气压式搅拌培养系统 3、旋转式培养系统 4、固定化培养系统 （四）利用细胞培养生产有用物质 1、一般程序： （1）选材 a、对其有效成分有充分了解 b、有测定有效成分的可靠方法 c、市场短缺与价格 d、取有效成分的部位，且该部位易形成愈伤组织 （2）、细胞体系的建立 （3）、大量培养 （4）、产品的提取与纯化 2、提取有用物质生产效率的技术因素： （1）筛选高产细胞系 （2）两步培养法 （3）培养基中加入有用物质的前体 （4）培养基中激素的作用 （5）培养条件 （6）采用固定化培养系统 5.7 细胞悬浮培养主要应用 1、 植物有用物质的生产 2、诱发和筛选突变体 3、原生质体培养和细胞分离 4、食品生产。 物理方法和化学方法。 物理方法主要是通过对细胞物理特性（细胞或小细胞团的大小）或生长环境条件（光照、温度等）的控制，实现高度同步化，其中包括按细胞团的大小进行选择的方法和低温休克法等。 悬浮培养细胞同步化的方法有两类： 化学方法的原理是使细胞遭受某种营养饥饿，或是通过加人某种生化抑制剂阻止细胞完成其分裂周期。化学方法中常用的有饥饿法和抑制法两种。 （一）饥饿法 在这种方法中，先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1期或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。 （二）抑制法 使用DNA合成抑制剂如5-氨基尿嘧啶、羟基脲和胸腺嘧啶脱氧核苷等，也可使培养细胞同步化。当细胞受到这些化学药物的处理之后，细胞周期只能进行到G1期为止，细胞都滞留在G1期和S期的边界上。当把这些抑制剂去掉之后，细胞即进入同步分裂。应用这种方法取得的细胞同步性只限于一个细胞周期。 5.4 细胞增殖的测定 1. 细胞鲜重 将悬浮培养物倒在下面架有漏斗的已知重量的湿尼龙丝网上，用水洗去培养基，真空抽滤以除去细胞上沾着的多余水分，称重，即求得细胞鲜重（fresh