论文--五子衍宗方对雄性小鼠生殖能力促进作用的系统评价.docVIP

PAGE PAGE 5 五子衍宗方对雄性小鼠生殖能力促进作用的系统评价 摘要 男性精液质量和男性生育力呈下降趋势是全球性的普遍现象，不孕不育已经成为一种新的常见病。对男性生育力/精液质量的正向干预研究重要意义。大量的临床实践和研究报告证实，五子衍宗丸在男性精液质量和男性生育力促进方面具有明确的作用，但有关机制尚未明确。 本研究通过对NIH、ICR、Balb/c雄性小鼠白消安无精子模型的动物实验，造模后给予2个生精周期的中药处理，以生精干细胞为靶标，对经典方剂五子衍宗方的中成药、单味药和单味药的有效成分提取物纯品分别分为高中低3个剂量组，进行系统综合评价，通过动物外观肾虚型症状表现、组织重量、精子质量、睾丸组织形态学、c-Kit、Oct4、SCF、Bcl-2、Bax、Ki67免疫组织化学技术和生精干细胞的评价、基因芯片技术、mRNA表达、蛋白表达等指标分析，显示五子衍宗方不同药品，均具有促进生精能力和精子质量提高的明确作用；睾丸组织生精/生精干细胞相关基因mRNA的检测结果显示，五子衍宗丸方可以调控SCF、c-kit基因的表达。全方、单味和提取物纯品的量效关系正在进行深入的研究。结论，五子衍宗方对精子质量/生精细胞/生精干细胞具有明确的正向促进作用 关键词：五子衍宗丸，生精干细胞，精子质量，精子生成，补肾药 全球范围内，人类精液质量随着环境质量的变化呈现普遍下降的趋势引起极大关注（1992，丹麦，E. Carlsen和A. Giwercman）。本课题组的研究表明：我国男性精子数目以每年1%的速度下降，工业化程度越高的地区降低越快，具有在青壮年人群中更加下降快的特点（1999,2002,2008,2003，张树成），导致男性生育力明显减低，男性不育患者明显增加。 对于男性精液质量的促进，西医的方法多以激素及其类似物为主，手段有限，而传统中医药在治疗精液质量异常所导致的男性不育时中医中药具有特殊优势。 中医对“精”的理解有多重内容，除了对男性生殖的含义外，包含人体正气的基本和根本。西方医学的“生精”作用是狭义的精子生成过程，是实验手段可科学的观察和认识的过程。中医生精内涵的广义，正式强调了整体调节的意义，而不单拘泥于某一细节。在治疗上强调个性化，辨证施治，针对病人不同的整体情况选用不同的手段和方药而达到改善生育力的目的。最终的临床治疗效果，是中西医学共同追求的目标。因此，精子生成是可通过实验手段认知的过程，提供了中医观察生“精”效果的可实验观察的指标。 五子衍宗方是中医男科精华中的经典名方，对男性不育症有较好的疗效，成为补肾生精的经典方剂，临床上大量有效方剂多以此为基础化裁形成。本课题组的研究思路是：以生精干细胞为靶点，将诱导、激发和促进成体组织中“潜伏”的干细胞活性这一新的概念用于到补肾药干预效果的评估，通过生精障碍动物模型，对经典方剂五子衍宗方的中成药、单味药、单味药的有效成分提取物纯品进行系列试验评价。 传统中医药宝库是我国开展生殖健康研究的特有资源和先天优势。开展中医药与男性生殖健康方面的研究是我国人口与健康发展战略的需要，是社会发展的重大需求。将现代干细胞前沿理论的思想，引入到传统中医中药体系中，对生精干细胞具有正向调节作用的五子衍宗方的系统机制认识，并应用于临床加以验证。 材料和方法 1.实验动物：无特定病原菌( SPF级，三级动物) 成年10～12周龄NIH、ICR 、Balb/c三个品系雄性小鼠。 2.主要试剂：五子衍宗丸( 批号4030124，北京同仁堂)，白消安（Sigma），二甲基亚砜( DMSO，Axygen)， TRIZOL（Invitrogen）；菟丝子、覆盆子、车前子、枸杞子、五味子的5种饮片（北京同仁堂药店）；菟丝子黄酮、覆盆子酮、车前子皂苷、枸杞多糖、五味子素（陕西森弗药业公司）。 3.动物模型：采用白消安无精子症动物模型，30mg kg－1单次腹腔注射给药不同品系动物，40天后，存活动物造模成功。 4.实验方法：将模型动物，分为中药高中低剂量组（成人临床等效剂量换算剂量），连续灌胃给药不同中药品78d( 2个小鼠生精周期)，为高中低实验组；灌胃给纯净水为自然恢复对照组（阴性对照组）。以溶媒对照动物，灌胃给纯净水为溶媒对照组；以正常动物为正常对照组（阳性对照组）。进行第2种品系动物的重复性试验。 5.观察指标和方法 1）有动物最后1次给药24h后，称体重，断脊处理，取出双侧睾丸和附睾前列腺储精囊会阴复合体。一侧的睾丸和附睾固定于Bouin液中。 2）另一侧附睾组织，采用附睾头-培养基泳动法进行精子质量观察精子活力、活动率和精子数目。 3）另一侧睾丸，迅速液氮冷冻后，于－80℃冰箱中保存，用于分子生物学 4）组织学观察：常规石蜡包埋，5 m切片，HE染色，封片，镜检观察。 5）免疫组化采用睾丸