共聚焦显微镜-汇报.pptVIP

我的实验计划 微生物分布 污泥结构三维重构 污泥分层结构 鼠成纤维细胞 单克隆anti–β-tubulin 标记 高清晰成像 检测人类癌细胞表皮生长因子 高清晰成像 培养的293细胞绿色荧光蛋白 高清晰成像 培养的人肝癌细胞哑叮橙染色 高清晰成像 透射光扫描（DIC） 利用激光透射扫描成像，用特殊滤光片达到相差显微镜的效果，可获得清晰的具有立体感的图片 树突状细胞 培养细胞 荧光表达量测定 Sunil S et al., Extracellular polymeric substances and structural stability of aerobic granule, Water Research, 42(2008)1644–1650 分层扫描（切片扫描） 按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。 分层扫描（切片扫描） 当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。 入射光 被检测层面 整个样品 白光（不能透过） 发射光 分层扫描（切片扫描） 较厚层面 较薄层面 人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。 分层扫描（切片扫描） 较厚层面 （平滑肌损伤可见） 较薄层面 兔动脉血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。 分层扫描（切片扫描） 连续分层扫描，可得到CT片类似的效果，对样品Z轴的结构进行分析。经计算机数据重组，可观测空间结构，空间定位，三维重组。 利用专用图象处理软件，还可以实现其他许多数据分析。 植物切片三维重建 多色荧光标记检测 普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。 Mouse 3T3 cells 红色：ethidium homodimer–1 ，染核 绿色：BODIPY FL phallacidin，染肌丝蛋白 牛肺动脉内皮细胞 蓝色：Hoechst 33342 染DNA 红色：PI，染核仁RNA 绿色：Alexa Fluor 488 染肌丝蛋白 藤黄微球菌 绿色：活菌 红色：死菌 染色：LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit 猴胚肾细胞内弓形虫繁殖 吖叮橙染色 绿色为DNA 红色为RNA 激光共聚焦显微镜的优势 在结构方面 激光做光源，光色纯，波长固定，成像效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高 可实现分层扫描 可实现连续扫描，可动态记录变化 可多根激光管同时扫描，多色荧光同时成像 扫描速度快，对样品损伤小 激光共聚焦显微镜的优势 在应用方面 形态观察--高清晰成像 半定量--荧光强度分析 荧光探针表达量测定 定位研究--分层扫描 多种荧光标记同时检测 荧光标记物绝对定量分析 扩展应用---如，FRAP法、细胞切割、细胞筛选等 激光共聚焦显微镜的优势 在效果方面更灵敏： 共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。定位更精确： 不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因 定量测量： 静态的定量测量 对于不同组的样品，可以单纯比较一种成分，也可以同时比较两种甚至三种成分。也可以在同一张切片上比较不同成分含量。 动态的定量测量 共聚焦显微镜还能对活细胞内的特定成分（如：钙、钠、氢等）进行动态变化测量，并给出动态变化曲线；还可以同时测量几种成分，并给出含量比值。 激光共聚焦显微镜的优势在效果方面 快速性： 由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。数据图像可及时输出或长期储存： 用计算机代替了普通的照相机，得到的图像是数字化的，不存在暴光方面及胶卷冲洗方面的问题（如荧光太弱，无法暴光；或曝光过程中荧光淬灭等）；而且图像可进一步加工处理。 激光共聚焦显微镜的优势在效果方面 共聚焦显微镜应用领域 （一）细胞生物学：细胞结构：细胞骨架，细胞膜结构、流动性、受体，细胞器结构和分布变化，细胞凋亡、细胞周期等。 （二）生物化学：酶、核酸、荧光原位杂交、受体分析。 （三）药理学：药物对细胞的作用及其动力学分析。 （四）生理学：膜受体，离子通道，细胞内离子含量、分布及其动态分析。 共聚焦显微镜应用领域 （五）遗传学和胚胎学： 细胞生长、分化，细胞组织的三维结