双萤光素酶分析实验操作步骤.docVIP

双荧光报告基因检测系统简明操作步骤 试剂准备： 磷酸盐缓冲液(PBS) PBS 缓冲液， 10X (每升) 11.5g Na2HPO4 2g KH2PO4 80g NaCl 2g KCl 溶于 1 升无菌去离子水中。 1XPBS的 pH应为 7.4. 1. 制备被动裂解缓冲液 1×PLB：将 1 倍体积的 5×Passive Lysis Buffer(PLB)加到4 倍体积的蒸馏水中。混合均匀。储存在 4℃（≤1 个月） 。建议每次使用前配制新鲜的 1XPLB。5XPLB 应储存在-20℃ 2．LARⅡ：用 Luciferase Assay Buffer Ⅱ溶解冻干粉 Luciferase Assay Substrate。存于-20℃（≤1 个月）或-70℃（≤1 年） 3．Stop Glo 试剂： a. 取 2.1ml 50×Stop Glo? Substrate 加到 105ml的 StopGlo? Buffer。在提供的棕色 StopGlo? Reagent 瓶中，振摇 10 秒。在-20℃存15 天。 b.若配制少量的 1×Stop Glo? Reagent：将一定量的 50×Stop Glo? Substrate 加入到所需要量的Stop Glo? Buffer 中，使终浓度成为 1 倍浓度。 （例如，加 0.2ml的 50×Stop Glo? Substrate到 10ml 的 Stop Glo? 缓冲液中，制成 1×Stop Glo? Reagent 溶液。） 细胞裂解 1． 除去培养细胞中的培养基。 2． 用 1×PBS 清洗培养细胞。去掉清洗液。 3． 按推荐体积（见下表）将 1×PLB 加入到培养孔中。 第 3步中使用的1×PLB体积 被动裂解 主动裂解 培养板 1×PLB 平板大小 1×PLB 6 孔 500ul 100×200mm 1ml 12 孔 250ul 60×15mm 400ul 24 孔 100ul 35×12mm 200ul 48 孔 65ul 6 孔 250ul 96 孔 20ul 12 孔 100ul 4． 被动裂解：在室温轻缓晃动培养板 15 分钟，把裂解液 转移到检测试管中。 结果检测 a.检测96孔板中的样品： 开始之前： 设置自动进样器 1 和 2 分别分装 100ul 的 LARII 和StopGlo?试剂。 测量时，使用 1-2 秒延迟和 5-10 秒读数。（在萤光发光仪上（Luminometer）之内） 1、加入≤ 20ul PLB裂解液/孔 2、加入 100ul LARII 3、检测萤火虫萤光素酶 4、加入 100ul StopGlo? 试剂 5、检测海肾萤光素酶的活性 6、其它孔如此循环操作。 b.用手动或配有单自动进样器的萤光发光仪进行检测： 1、事先在检测管中加入100ul LARII 2、转移 20ul PLB 裂解液到检测管中，混合。 3、检测萤火虫萤光素酶的活性 4、向检测管中加入 100ul StopGlo? Reagent 5、检测海肾萤光素酶活性