研究生基因工程原理.pptVIP

基因工程原理 郭霄峰 三、应用扣除杂交 第二节 质粒DNA的分离纯化 一、氯化铯密度梯度离心法 在细胞裂解和DNA的分离过程中，染色体常常发生断裂。线性DNA、开环DNA与环状DNA结合溴化乙淀后的密度不同，cccDNA-EtBr的密度大、L-DNA和O-DNA-EtBr的密度小。用不同梯度的CsCl分离质粒， cccDNA-EtBr在L-DNA和O-DNA-EtBr的下面。 蛋白质 L-DNA和O-DNA cccDNA 二、碱变性法 关键试剂是溶液II，其pH为12-12.5，在此环境下，线性DNA变性，而环状DNA保持不变。 I：Tris-HCl（pH8）、葡萄糖、EDTA、溶菌酶。 II：NaOH、SDS。 III：NaAc 三、影响质粒产量的因素 1、需去除了endA的菌株 2、质粒的拷贝数。 第三节 质粒载体的构建 一、质粒载体必需具备的基本条件 1、具复制起点 2、具有抗菌素抗性基因 3、具多克隆位点 4、分子量较小，拷贝数高。质粒一般只能克隆10KB的外源基因。 二、质粒载体的选择标记 产生的蛋白质对细菌的膜修饰，阻止四环素进入菌内。 作用30S亚基，干扰蛋白合成。 四环素 产生的特殊酶，修饰链霉素。 作用30S亚基，导致mRNA错译。 链霉素 产生的氨基糖苷磷酸转移酶，修饰卡那霉素。 作用70S亚基，导致mRNA错读。 卡那霉素 产生乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化失活。 作用50S亚基，干扰蛋白合成。 氯霉素 产生β-内酰胺酶，破坏β-内酰胺环。 干扰细菌胞壁的合成 氨苄青霉素 抗性机理 作用方式 抗菌素名称 第五章 噬菌体载体和柯斯载体 第一节 噬菌体的一般生物学物性 一、形态及结构特点 二、噬菌体的感染性 三、噬菌体的溶菌生命周期 1、吸附 2、注入 3、转变 4、生物合成 5、组装及释放 四、噬菌体的溶源生命周期 1、基本概念 温和噬菌体 溶源性细菌 溶源化 整合 原噬菌体 阻遏物 2、超感染免疫性 3、溶源菌的诱发 五、重组噬菌体的分离 第二节 λ噬菌体载体 一、 λ噬菌体的分子生物学特征 基因组结构 二、λ噬菌体载体的构建 1、原理 2、λ噬菌体载体的主要类型 插入型载体、替换型载体 GGGCGGCGACCT CCCGCCGCTGGA 3′ 3′ 三、 λ重组体DNA的体外包装 1、转染 2、体外包装 3、包装限制 75%-105% 四、选择 第三节 柯斯质粒载体 一、柯斯质粒载体的构建 二、柯斯质粒载体的特点 第六章 基因的分离与鉴定 第一节 DNA克隆片段的产生与分离 一、基因组DNA的获取 1、酶切法 单酶法、双酶法 2、机械剪切法 3、RT-PCR或PCR法 二、DNA片段的分离 电泳、离心。 第二节 重组DNA分子的构建及导入受体细胞 一、外源DNA分子与载体的连接 1、单向克隆 2、定向克隆 3、粘性未端 4、平未端 5、影响连接的因素 温度、克隆片段的大小、分子比例、分子浓度、连接时间。 二、重组质粒导入受体细胞的途径 1、转化 2、电转化 3、显微注射 4、转导 5、转染 6、影响因素 第三节 基因克隆的实验方案 一、克隆载体的选择 质粒载体（15KB）、λ噬菌体（25KB）、柯斯载体（45KB）。 二、基因文库 汇集着某种生物基因组所有的DNA序列的重组体DNA群体。 Ln（1-P） Ln（1-f） N= N为一个完全基因文库所包含的重组DNA的转化子克隆数，P为目的基因的几率（一般99%），f为克隆片段的大小与基因组DNA总量之比。 三、cDNA的克隆 1、mRNA与含Oligo dT的纤维素柱结合，纯化mRNA。 2、合成第一链cDNA。 3、合成双链cDNA 4、DNA片段与载体的连接 四、全长cDNA合成 1、oligo（dG）合成引导法 2、载体引物合成法 AAAAAAA AAAAAAA TTTTTTT mRNA cDNA AAAAAAA TTTTTTT CCCCCC CCCCCC GGGGG TTTTTTT AAAAAA 五、基因组DNA的克隆 1、应用λ噬菌体 2、应用柯斯质粒 第四节 克隆基因的分离 一、应用核酸探针 1、探针的制备 2、克服假阳性 猜测体探针， PCR猜测体技术 二、应用差别杂交 第三章 基因克隆的酶学基础 第一节 核酸内切限制酶 一、类型：I、II、III类。 二、II型酶的基本特性 1、基本特性 设别序列的回文结构