氨基酸薄层层析实验报告课件.docVIP

生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 氨基酸的薄层层析 实验日期 实验地点 合作者 指导老师 评分 教师签名 批改日期 一、实验目的 1.1. 掌握薄层层析法的一般原理。 1.2. 掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。 1.3. 掌握如何根据移动速率（ Rf 值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液） 。 二、实验原理 2.1. 薄层层析法是色谱分析技术的一种 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固 定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的 溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以 彼此分开。（即通过吸附 - 解吸- 再吸附- 再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来） 。 2.2. 氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛， 与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。 2.3. 混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率— Rf 值来表示。 层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为 Rf 值。由于物 质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（ Rf 值）也是恒定的，因此可以根据 Rf 值来鉴定被分离的物质。 （Rf=斑点至原点距离 / 溶剂前缘至原点距离） 三、材料与方法： 3.1. 实验材料： 3.1.1. 实验试剂：①分析样品：氨基酸混合液；②吸附剂： 硅胶；③粘合剂： 0.5% 的羧甲基纤维素钠；④氨基酸的异丙醇溶液；⑤丙氨酸、精氨酸、甘氨酸；⑥展开 - 显 色剂（正丁醇、乙酸、水、茚三酮溶液） 3.1.2. 实验器材：①层析板、尺子、铅笔；②烧杯、玻棒、量筒；③吹风机；④毛 细管、层析缸；⑤药匙；⑥烘箱 3.2. 实验步骤： 制板 点样 层析 显色 处理与结果分析 3.2.1. 制板：①调浆： 称取硅胶 3 克，加 0.5%的羧甲基纤维素钠 8 毫升，调成均匀 的糊状；②涂布：取洁净的干燥玻璃板均匀涂层；③干燥：将玻璃板水平放置，室温下 自然凉干；④活化： 70℃烘干 30 分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取 出。 3.2.2. 点样：①位置：用铅笔距底边 2cm水平线上均匀确定 4 个点。每个样品间相 距约 1cm；②取样：用毛细管分别吸取氨基酸溶液，取样量为毛细管柱高 5cm；③点样： 点样毛细管轻轻接触薄层表面点样。加样后原点扩散直径不超过 2mm。 3.2.3. 层析和显色：将薄层板点样端浸入展层 - 显色剂，展层- 显色剂液面应低于点 样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端 2cm时，停止展层，取出薄 板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干或在 85℃下烘干，即可显出各层斑点。 3.2.4. 处理和结果分析：小心量出斑点中心至原点中心距离，再量出原点中心至溶 剂前沿的距离，计算出它们的 Rf 值。根据 Rf 值，鉴定出混合样品中氨基酸的种类，并 绘出层析图谱。 3.3. 注意事项：①切勿用手直接接触薄层板面；②点样过程中必须在第一滴样品干 后再点第二滴；③样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多，易造成 斑点过大， 互相交叉或拖尾。 四、结果与讨论： 4.1. 实验结果 4.1.1 氨基酸的薄层层析实验结果 样品 斑点- 原点 溶剂前缘- 原点 Rf 值 Arg 2.4cm 5.4cm 0.44 Gly 1.1cm 5.4cm 0.20 Ala 3.0cm 5.4cm 0.37 混合液 A 2.5cm 5.4cm 0.46 混合液 B 2.1cm 5.4cm 0.39 混合液 C 1.3cm 5.4cm 0.24 图一 失败品（左） 和层析板（右） 图二 实验后结果 4.1.2. 实验现象： ①第一次制板过程中，将糊状物均匀倒到洁净玻璃板中央部分，用药匙均匀涂满玻 璃板，用手左右上下将其摇晃后，糊状物在大部分地方均匀形成涂层，但在其中一侧形 成水纹样，无论如何摇晃无法去除；而在第二次制板过程中，重复以上步骤后，糊状物 均匀的在玻璃板上形成涂层。 （如图一） ②点样后，溶液逐渐干燥，不能明显看清斑点。层析约 30min 后溶剂前缘达到层析 板的 1/2 左右，前缘大约形成一条直线，用铅笔和直尺轻轻描绘出这一条线。利用烤箱 烤干后，层析板上出现 6 个红紫色斑点。（如图二）用直尺和铅笔记录斑点至原点距离 和溶剂前缘至原点距离。 4.2. 结果讨论与误差分析 ①第一次制作的层析板之所以会出现水纹样， 可能是因为在搅拌混匀的过程中没有 混匀，也可能是因为玻璃板事先被弄脏了，所以无论如何摇动无法去除水纹样。再