亚硒酸钠联合长春新碱对HT—29结肠癌细胞的影响.docVIP

PAGE PAGE 1 亚硒酸钠联合长春新碱对HT—29结肠癌细胞的影响 　　【摘要】目的探讨亚硒酸钠联合长春新碱对人结肠癌细胞HT-29的影响及机制。方法HT-29细胞分4组培养，对照组（不施加处理因素），亚硒酸钠组（含10μmol/L亚硒酸钠），长春新碱组（含40μg/L长春新碱），联合给药组（10μmol/L亚硒酸钠+40μg/L长春新碱），分组24、48、72h后以噻唑蓝（MTT）比色法检测各组细胞活力，根据MTT比色结果检测HT-29细胞活力下降最明显时细胞周期蛋白CyclinD1的表达。结果亚硒酸钠及长春新碱均可下调HT-29细胞CyclinD1蛋白表达并抑制细胞活力，联合给药组HT-29细胞CyclinD1蛋白表达下调更为明显，细胞活力降低也更为明显。结论亚硒酸钠及长春新碱均可通过降低CyclinD1蛋白表达抑制HT-29细胞活力，联合给药对HT-29细胞抑制更为显著。 　　【关键词】亚硒酸钠；长春新碱；HT-29细胞；细胞活力 　　结肠癌是一种常见的肿瘤疾病，严重威胁着人类的健康，但其发病机制不清，目前仍无有效治疗手段。微量元素硒与肿瘤发生关系密切，结肠癌患者体内常缺乏含硒化合物[1]，硒缺乏可能是结肠癌发生的重要机制之一。长春新碱在结肠癌的治疗过程中发挥了重要作用，但副作用较为明显，在一定程度上限制了其临床应用，积极探索长春新碱的配伍用药，减少其用量具有重要临床意义。因此，本文拟探讨亚硒酸钠与长春新碱联合用药对结肠癌细胞HT-29的影响及机制，以期为结肠癌的临床用药提供理论基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料及仪器HT-29结肠癌细胞株（中科院上海细胞库），DMEM培养基及胎牛血清（Gibco公司），噻唑蓝（MTT，南京建成生物工程研究所），CyclinD1蛋白抗体（Santa公司），酶标仪（北京普郎克公司）。 　　1.2实验分组以1×104/孔的密度将HT-29细胞接种于96孔板内分组培养，对照组不添加处理因素（MDEM培养基+10%胎牛血清），亚硒酸钠组含10μmol/L亚硒酸钠，长春新碱组含40μg/L长春新碱，联合给药组含10μmol/L亚硒酸钠及40μg/L长春新碱。 　　1.3MTT法检测HT-29细胞存活率分组培养24、48、72h后，换无血清培养基培养4h，96孔板每孔加入20μlMTT（5mg/ml），4h后弃去培养液加入150μl二甲亚砜并振荡15min，酶标仪490nm波长检测各孔吸光度（A值），细胞活力=检测组A值/对照组A值×100%。 　　1.4Western-blot检测CyclinD1蛋白表达根据MTT实验结果，检测细胞活力降低明显时HT-29细胞CyclinD1蛋白表达。粉碎细胞后4℃12000r/min离心15min，测定并调节上清蛋白浓度，SDS电泳蛋白并转移至PVDF膜，以CyclinD1蛋白及β-actin一抗室温下分别孵育2h，再以辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h，利用ECL发光试剂盒显影。以β-actin为内对照，观察CyclinD1蛋白表达变化。 　　2结果 　　2.1亚硒酸钠及长春新碱对HT-29细胞活力的影响 　　MTT实验显示，亚硒酸钠及长春新碱均可抑制HT-29细胞活力，联合用药效果更为显著。分组72h后HT-29结肠癌存活率降低最为显著，因此本研究检测了分组72h后CyclinD1蛋白表达变化（表1）。 　　2.2亚硒酸钠及长春新碱对HT-29细胞CyclinD1蛋白表达的影响 　　Westernblot检测显示，亚硒酸钠及长春新碱均可下调HT-29细胞CyclinD1蛋白表达，且联合用药CyclinD1蛋白表达降低更为明显（图1）。 　　3讨论 　　结肠癌是一种临床常见病多发病，在40～50岁年龄组发病率为高，结肠癌患者体内硒元素含量常明显降低[1]，补充硒可以有效降低大鼠及小鼠的皮肤癌、乳腺癌、肝癌及结肠癌的发生率[2]，但其机制尚不完全清楚。CyclinD1是一种细胞周期蛋白，与细胞增殖分化关系密切，可促进细胞生长分裂CyclinD1蛋白表达上调是癌细胞永生化的重要机制之一。研究发现，大肠癌组织中CyclinD1蛋白表达明显上调[3]，且直结肠癌细胞HCT116和SW480中CyclinD1也有表示上调表现[4]。本研究显示，HT-29人结肠癌细胞中CyclinD1蛋白大量表达，给予亚硒酸钠可明显抑制HT-29结肠癌细胞CylinD1表达，并抑制HT-29细胞活力。研究结果提示CylinD1表达上调是HT-29细胞增殖分化的重要机制之一，下调CylinD1表达可能是亚硒酸钠降低HT-29细胞活力的重要机制之一。 　　长春新碱是一种从长春花中提取的生物碱，抗肿瘤作用已获得广泛认可，但其毒副作用较强，对神经系统的毒副作用尤为明显，且长