碱性磷酸酶km值测定.pptVIP

酶促反应动力学研究方法介绍 实验目的 学习环境因素对酶促反应速度的影响； 学习米氏方程及Km值得测定； 测量碱性磷酸酶km值； 实验原理 E的反应速度受到环境因素的影响，这些因素包 括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等 （一）米－曼氏方程式 中间产物 推导过程 稳态：是指ES的生成速度与分解速度相等，即 [ES]恒定。 K1 ([Et]－[ES]) [S]＝K2 [ES] + K3 [ES] （二）Km与Vmax的意义 Km值 ① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 ② 意义： a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。 Vmax 定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。 （三）Ｋm值与Ｖmax值的测定 双倒数作图法(double reciprocal plot) 酶浓度对反应速度的影响 当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。 关系式为：V = K3 [E] 温度对反应速度的影响 双重影响 温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低 。 碱性磷酸酶km值的测定 【试剂】 1．酚试剂 2．2.5mmol／L磷酸苯二钠基质液 3．碱性缓冲液(pH-10.0) 4．碱性磷酸酶液 操作 实验数据及结果 Km值的定义和意义是什么？ 米氏方程度表达式是什么，如何求出Vmax和Km？ * * EXPERIMENT 3 碱性磷酸酶km值测定 酶促反应模式——中间产物学说 E + S k1 k2 k3 ES E + P 相关E学原理 ※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式( Michaelis equation)。 [S]：底物浓度 V： 不同[S]时的反应速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant) Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ ── 米－曼氏方程式推导基于两个假设： (1) E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即 V＝k3[ES]。 (2) S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。 K2+K3 ＝ Km （米氏常数） K1 令： 则(2)变为: ([Et]－[ES]) [S] ＝Km [ES] (2) ＝ ([Et]－[ES])[S] K2+K3 [ES] K1 整理得： 当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即[Et]＝[ES]，反应达最大速度 Vmax＝K3[ES]＝K3[Et] (5) [ES]＝─── [Et][S] Km + [S] (3) 整理得: 将(5)代入(4)得米氏方程式： Vmax[S] Km + [S] V＝──── 将(3)代入(1) 得 K3[Et][S] Km + [S] (4) V＝──── 当反应速度为最大反应速度一半时 Km值的推导 Km＝[S] ∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。 2 ＝ Km + [S] Vmax Vmax[S] Vmax V [S] Km Vmax/2 意义：Vmax=K3 [E] 如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶的转换数(turnover number)，即动力学常数K3。 定义 — 当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。 意义 — 可用来比较每单位酶的催化能力。 酶的转换数 -1/Km 1/Vmax 1/[S] 1/V Vmax[S] Km+[S] V = 林-贝氏(Lineweaver-Burk)方程 + 1/V= Km Vmax 1/Vmax 1/[S] 两边同取倒数 Hanes作图法 [S] [S]/V -Km Km/Vm 在林－贝氏方程基础上，两边同乘[S] [S]/V=Km/Vmax + [S]/Vmax 0 V [E] 当[S][E]时，Vmax = k3 [E] 酶浓度对反应速度的影响 最适温度 (optimum temperature)： 酶促反应速度最快时的环境温度。 * 低温的应用 酶 活 性 0.5 1.0 2.0 1.5 0 1