免疫实验课件-五年制实验课 小鼠脾脏单个核细胞分离-新.pptVIP

2013级五年制本科生免疫学实验课 小鼠脾脏单个核细胞的分离 实验内容 小鼠脾脏单个核细胞的分离（实验） 淋巴细胞分离及检测技术（讲解） 实验目的 掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离及淋转的原理和方法 熟悉淋巴细胞的检测技术 细胞分离纯化的目的 测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。 根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力； Ficoll密度梯度离心法 常用来分离单个核细胞的分层液：比重是 1.077左右的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)分层液。 红细胞、粒细胞比重大(1.092)，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重(1.070)，离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血/组织液中分离到单个核细胞。 本次课分离小鼠脾脏单个核细胞 Ficoll Ficoll密度梯度离心法 脾细胞悬液 培养液 实验材料 分组：两人一组， 每组一只小鼠 器材 数量 试剂及动物 数量 滴管 1支/2人 分层液 1ml/2人 EP管 3个/2人 PBS 1瓶/4人 计数板 1块/2人 计数液 1瓶/室 1ml加样器(tip) 1把/4人 RPMI1640（无血清） 100ml/室 20ul加样器(tip) 1把/4人 RPMI1640(5%NCS) 100ml/室 滴管 1支/2人 平皿（含纱布块 ） 1套/4人 剪刀、镊子 1套/4人 显微镜 1台/4人 实验步骤 1、处死小鼠，取 4 ml 无血清RMPI 1640 培养液放入平皿中。 2、取出脾脏放到平皿中，将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000μl加样器隔着纱布将细胞悬液吸出，放入1.5ml EP管中，做好标记。 3 、加样：吸取2ml细胞悬液沿试管壁缓慢加至分层液顶部(距1cm处) NOTE：不要打破细胞悬液与分层液的界面； 4、1800 转，室温离心 30 分钟； 5、用毛细管插入液面下，尽量吸取白色毛玻璃层，放入EP管中； NOTE：尽量少吸分层液； 6、每管加 PBS 到1ml，重悬细胞，3000转离心5分钟。 7、计数：吸弃上清，用100ml PBS重悬细胞，取出20ml加入新的EP管中，再加入20ml细胞计数液，混匀后取出10ml，加到计数板内，显微镜下计数。 细胞计数方法 查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数 4 淋巴细胞分离及检测技术 巨噬细胞 淋巴细胞 DC细胞 红细胞 淋巴细胞分离及检测技术 淋巴细胞的分离 淋巴细胞的功能测定技术 淋巴细胞分离 一、外周血单个核细胞的分离 淋巴细胞分离液密度梯度离心法 二、淋巴细胞亚群的分离及鉴定 1. E花环分离法 2. 尼龙纤维分离法 3. 流式细胞术 4. 磁珠分离术 E花环分离法（纯化T细胞） T细胞表面的CD2分子－绵羊红细胞受体（E受体） 尼龙纤维分离法 B细胞和单核细胞具有易粘附特性，将淋巴细胞悬液加到尼龙纤维上，37℃作用1－2小时后，洗脱的为非粘附性T细胞。 T细胞 尼龙纤维 毛柱 PBMC B细胞 单核细胞 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） FCM将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，是当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。 流式细胞仪工作原理 Page *