植物细胞及原生质体培养.pptVIP

第 八 章 植物细胞及原生质体培养;第一 节 植物细胞培养;植物细胞培养的意义： （1）研究细胞生理代谢过程及各种影响因子； （2）用于植物品种的改良； （3）用于植物次生代谢物质的生产。;单细胞培养 细胞的悬浮培养 ;一、单细胞培养（通常以叶片为材料） （一）单细胞的分离 分离方法：机械法和酶解法。各有优缺点。;（二）单细胞培养 对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直到长成完整植株的技术。 培养方法：平板培养、看护培养、微室培养、条件培养基培养法。;（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。 方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶等)消化分散纯化的细胞，经计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左右的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密封，于25℃培养，约20天后细胞即可生长成团。统计生长情况。 ;;（2）看护培养法：从悬浮培养物或脆弱愈伤组织上用针或玻璃毛细管分离单细胞，每个细胞放在一个方形滤纸片的上表面，而滤纸片放在活跃生长的愈伤组织上进行培养的方法。;（3）微室培养法：悬浮单细胞接种于凹玻片或玻璃环与盖玻片组成的微室内的固体培养基中的培养方法。 ;（4）条件培养基培养：条件培养基是在培养基中加入高密度的细胞进行培养。一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化。这样的培养被利用来进行某些单细胞的培养的方法。 ;二、细胞的悬浮培养(cell suspension culture) 是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。 适宜于大规模培养，细胞工程产业的技术基础。;（一）细胞培养过程： 1. 择适宜的外植体； 2. 诱导疏松愈伤组织； 3. 选择适宜的培养基； 4. 悬浮培养； 5. 悬浮细胞的继代与选择； 6. 悬浮细胞的同步化； 7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。 ; （二）悬浮培养类型： 1. 分批培养(Batch culture)： 分批培养是在一个封闭的系统中进行细胞培养，当培养物增加到一定量时，需继代培养，即取出少量培养物转接于新鲜培养液中。 生长过程与微生物类似，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶段。接种时细胞要达到一定细胞浓度，通常为0. 25 x l06细胞／ml -0. 5 x 106细胞／m1。 ;B. 连续培养(Continuous culture): 是用一定容积的非密闭系统进行细胞培养的方法，在培养过程中不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充，细胞生长和增殖连续进行，同时有等体积的培养物排除系统。 分为封闭型和开放型连续培养两种。;C . 半连续培养： 是利用培养罐等装置进行细胞大量培养的一种方式。在半连续培养时，当培养容器内细胞增殖到一定数量后，倒出一半细胞悬浮液于另一培养罐等容器，再分别加入新鲜培养基继续培养。半连续培养能够重复获得大量均一的培养细胞供进一步利用。; （三）优良悬浮培养体系要求： A. 悬浮培养物分散性好，细胞团较小，一般由几十个以下的细胞组成。 B. 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。 C. 生长迅速，悬浮细胞的量一般2—3天甚至更短时间便可增加一倍。 ;三、细胞培养的特性： 　1. 植物细胞较微生物细胞大，具有纤维素细胞壁，抗剪切力差； 2. 细胞生长速度慢，易受微生物污染，有时需用抗生素； 3. 细胞生长的中期及对数期，易凝聚为直径达350 um一400 um 的团块，悬浮培养较困难； 4. 培养时需供氧，培养液粘度大，不能耐受强力通风搅拌；并具有群体效应 5. 培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较低，培养过程具有结构与功能全能性。;1;　四、 植物细胞培养的营养需求及培养基 　１. 营养需求： 植物细胞生长所需营养较微生物细胞复杂，除水分外，其它营养成分可分为如下几类： (1) 无机营养: 如N、 P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I等； (2)维生素：如维生素B1、B6、烟酸、肌醇、生物素、泛酸钙及叶酸等； (3) 碳源: 如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等； (4)天然物: 如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、荸荠汁、生梨汁及苹果汁等； ;(5) 植物激素: 如生长素 、赤霉素、细胞分裂素 、脱落酸；其它有油菜素内酯、三十烷醇、肽类、半支莲醇、月光花素、石蒜