生物化学实验课件1 (动态.ppt

三、试剂和器材 （一）试剂： 　1. 碱性铜试剂：称10g无水NaCO3，加入100mL去离子水溶解，另称1.88g酒石酸，用100mL去离子水溶解，混合二溶液，再加入1.13克结晶CuSO4，溶解后定容到250mL。 2. 磷钼酸试剂：在烧杯内加入钼酸17.5g，钨酸钠2.5g，10% NaOH 100mL, 去离子水100mL，混合后煮沸约30min（小心不要蒸干），驱去钼酸中存在的氨，直到无氨味为止，冷却后加85%磷酸63mL,混合并稀释到250mL。 3. 0.25%苯甲酸200mL，配葡萄糖用，防止时间长溶液长菌，也可以用去离子水代替。 4. 葡萄糖标准溶液：（1）贮液：精确称取无水葡萄糖（应在105℃恒重过）0.1802克，以0.25%苯甲酸溶液溶解后，定容到100mL容量瓶中（浓度10mmol/L）。 （2）操作溶液：用移液管取贮液10mL，置于50mL容量瓶中，以用0.25%苯甲酸或去离子水稀释至刻度（浓度为2mmol/L）。 5. 0.2mol/L蔗糖溶液50mL，分装后冰冻保存，因蔗糖极易水解，用时取出一管化冻后摇匀。 6. 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.9，200mL。 （二）器材： 　1. 试管20支，试管架1个 2. 秒表1块，或用手表。 3. 移液管：0.1、0.2、2.0、5.0mL 4. 水浴锅 5. 电炉 6. 橡皮筋 7. 保鲜膜 四、操作方法 级分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ酶活力的测定： 　1. 用蒸馏水稀释各级分酶液（约5,000倍。根据纯化后酶活力大小可在实验十二稀释液的基础上进一步稀释）。 2. 按下页“表1”的顺序在试管中加入各试剂（mL），进行测定。 表 1 级分Ⅰ、II、III的酶活力测定 各管名称 对照 粗级分Ⅰ 热级分Ⅱ 醇级分Ⅲ 葡萄糖 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 酶液 0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0 0 H2O 0.60 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 1.00 0.80 乙酸缓冲液 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0 0 葡萄糖 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.20 蔗糖 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0 0 加入蔗糖，立即摇匀开始计时，室温准确反应10分钟 碱性铜试剂 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 沸水浴加热8分钟 磷钼酸试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 H2O 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 A650nm E’ 平均’ 原始酶液’ 五、结果计算 1. 稀释后酶液的活力（按还原糖计算）： 式中： A650：第2~10管所测A650 A’650：第12管所测A650 0.2：第12管葡萄糖取样量 2：标准葡萄糖浓度（2mmol/L = 2μmol/mL） 10：反应10min B：每管加入酶液的毫升数。 　　 2. 原始酶液的酶活力 E = (平均E’/2)×稀释倍数（Units / mL原始组分） ［注］：一个酶活力单位Units，是在给定的实验条件下，每分钟能催化1mole蔗糖水解所需的酶量，而水解1mole蔗糖则生成2moles还原糖，计算时请注意。 　　 3.酶纯化效果分析： 注：蛋白含量=蛋白浓度×校正体积 总酶活=酶活×稀释倍数 比活力=总酶活/总蛋白含量 纯化倍数=比活力之比 回收率=总酶活之比 　 为了测定和计算下面纯化表中的各项数据，对各个级分都必须取样，每取一次样，对于下一级分来说会损失一部分量，因而要对下一个级分的体积进行校正，以使回收率的计算不致受到不利的影响。 级分 记录体积 校正体积 蛋白质(mg/mL) 总蛋白 活力 总活力Units 比活力 纯化倍数 回收率 I 1.0 100 Ⅱ