生化实验05凯氏定氮法新版.ppt

Designed by XK Wang * 实验06 植物组织中总氮含量的测定 （微量凯氏定氮法） * 氮素代谢在植物新陈代谢中占有重要地位。测定氮素含量对于研究植物的营养生理，以及确定农产品品质、营养价值等均具有重要意义。 动植物组织中的氮包括蛋白氮和非蛋白氮两大类，主要以有机氮形式存在。由于蛋白质的含氮量相对稳定，测定出样品中总氮含量，再乘上一个系数即可得出样品中粗蛋白含量。如要准确测定蛋白质含量，则需利用三氯乙酸将样品中蛋白质沉淀出来，再分别测定蛋白氮和非蛋白氮。 组织中含氮量常用凯氏定氮法测定。 * 一、原理 在催化剂（如CuSO4、K2SO4、硒粉等）存在的条件下，将植物材料与浓硫酸共热，有机物氧化分解成CO2和H2O，其中的氮转变为氨，并进一步生成(NH4)2SO4，这个过程称为消化。在消化后的样品中加入过量的NaOH，经强碱碱化使之分解释放出NH3，通过蒸馏借蒸汽将NH3导入过量的硼酸溶液中生成四硼酸铵；再用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复到原来的H+浓度，根据盐酸的用量即可计算出样品中总氮的含量。 * 一、原理 以甘氨酸为例的化学反应式： 消化：CH2NH2COOH + 3H2SO4→2CO2 + 3SO2 + 4H2O+NH3 2NH3 + H2SO4 →(NH4)2SO4 蒸馏: (NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O + Na2SO4 + 2NH3↑ 2NH3 + 4H3BO3 →(NH4)2B4O7 + 5H2O 滴定：(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O →2NH4Cl + 4H3BO3 * 材料：面粉仪器设备：消煮炉、海能K9840型自动凯氏定氮仪、Titrette滴定计、分析天平、消化管、蒸馏管、容量瓶、三角瓶、移液管等。试剂： 1. 浓硫酸（AR级）；2. 30-40%（W/V）NaOH； 3. 2%硼酸溶液； 4. 0.01mol/L HCl标准溶液； 5. 混合催化剂； 6. 混合指示剂；  7. 30%H2O2; 8. 标准(NH4)2SO4溶液 二、材料、仪器设备及试剂 * 简易凯氏定氮蒸馏装置 海能K9840型全自动凯氏定氮仪 * 三、实验步骤 1. 样品消化（已完成） 准确称取0.1-0.2g样品（依其含氮量而定）至消化管中，加入5mL浓硫酸和0.3-0.5g混合催化剂，浸泡数小时后在管口盖一小漏斗，放在消煮炉上加热消化。开始时温度可稍低，加热至管口不再产生泡沫时可逐渐升温，使消化管内液体达到微沸，直到消化液褐色消失并全部变为清澈透明为止。 在消化过程中，可分数次加入少许H2O2以加速有机物氧化。如发现在消化管上部有黑色颗粒，应小心转动消化管，用消化液将其冲洗下来。整个过程一般需3-4小时，均应在通风橱中进行。 * 2. 定容： 消化液冷却后，沿管壁仔细加入10 mL左右无氨蒸馏水以冲洗管壁→冷却后转入100 mL容量瓶，再用少量无氨蒸馏水冲洗消化管数次，洗涤液一并转入容量瓶→冷却后用无氨蒸馏水定容至刻度，混匀后备用。 * 3. 蒸馏（1）使用前仪器检查：检查无氨蒸馏水（蓝色标签）、NaOH（30-40%、黄色标签）、H3BO3（2%、红色标签）三个试剂瓶是否装有规定的试剂、瓶盖是否盖紧（切忌漏气）；电源插头是否接通；冷却水源是否接牢。（2）加样：取10 mL样品消化液转入样品蒸馏管中，安装在定氮仪蒸馏管接口上（注意密接好）；安放承接蒸馏液的三角瓶（集液瓶）。 * 3. 蒸馏（3）开机：打开电源开关，仪器自动进入“自动、手动可选界面”。（4）参数设置：按“确认”键上、下箭头调光标于自动处，按下确认键，进入“当前参数”界面。参数值常规设置：稀释水量5mL、硼酸体积10mL、加碱体积10mL、蒸馏时间4-5min（第1个样品5 min，以后样品4 min）、淋洗水量5mL。 * 3. 蒸馏（4）工作：仪器自动显示“集液瓶是否放置到位” 。确认放置到位后按确认键，仪器按设定的程序和参数值进行自动蒸馏，蒸馏中显示顺计时工作状态。蒸馏到预定时间，仪器停止工作且自动回复到“自动、手动”可选界面。取下样品管和蒸馏液瓶用于滴定。（5）再次蒸馏：装上下一个待测样品管和集液三角瓶，按确认键3次后，仪器开始自动再次蒸馏。 * 3. 蒸馏 （6）空白蒸馏 用未加植物样品的消化液（其余试剂都加入并按同样方法进行消化）为空白液，按样品消化液的蒸馏方法进行蒸馏。注意事项：（1