实验设计-巩哲-13301050216.docx

巩A药物对心肌细胞缺血损伤的保护作用实验 一、实验目的 1.确定B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系。 2.确定A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中。 二、实验原理 1.CCK-8比色法 CCK-8试剂中含有WST-8，化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy?PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan）。生成甲瓒的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及细胞活力检测等。 2.Western Blot经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 三、实验器材 SD乳鼠，DMEM培养基，DMEM无糖无血清培养基，DMEM无血清高糖培养基，细胞培养板，标准胎牛血清，CCK-8工作液（原液：无血清高糖DMEM=1:10），兔抗人B蛋白多克隆抗体，HRP标记的羊抗小鼠IgG，酶标仪，电泳仪，比浊仪，移液枪，枪头等。 四、实验步骤 1.心肌细胞原代分离与培养 取1到2天新生的SD大鼠，无菌条件下取出乳鼠心脏，剥离心房及大血管组织，迅速置于预冷的不含钙离子、镁离子的磷酸缓冲液（PBS）中，反复冲洗3次，将其剪成碎块后放入锥形瓶中，加入0.125%的胰蛋白酶和0.08%的胶原酶Ⅰ消化。收集消化后的上清液，加入含10%新生牛血清的DMEM培养基，终止消化酶的作用。细胞悬液过滤后，上清液离心10min（850r/min），弃上清液，用DMEM培养基吹散沉淀细胞，接种培养瓶中，二氧化碳培养箱（37℃，5%CO2，95%空气）中静置培养85min，将培养液转移至6孔培养板，CO2培养箱中继续培养。取培养72h的单层细胞进行实验。 2.建立心肌细胞缺血损伤模型 实验分组：随机分为5组，空白对照组、药物对照组、模型组、A药物低剂量组、A药物高剂量组，每组1只6孔培养板。空白对照组不做任何干预，药物对照组加入含终浓度为20μmol/L的A药物；模型组放入氧终浓度为1%的密闭容器（密闭容器内冲入已制备好的含95%氮气，5%二氧化碳的气体，充气十分钟后，同时关闭进气口和出气口，使容器内氧终浓度为1%），同时将培养液更换为无糖无血清的DMEM培养液；A药物低剂量组按模型组方法并同时加入含终浓度为20μmol/L的A药物；A药物高剂量组则加入终浓度为40μmol/L的A药物。各实验组于干预后24h收集相应样本进行检测。 3.CCK-8法检测细胞活力 测定前吸弃原培养液，每孔加110μl CCK-8工作液，继续培养，CCK-8作用1h，用酶标仪在450nm波长处比色，测定吸光度。 4.Western Blot检测B蛋白 吸出培养液并收集，每孔加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M PH7.2~7.3）。轻轻摇动一分钟洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养板置于冰上。按1ml裂解液加10μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。每孔细胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，摇动培养板促进裂解。裂解完后，将细胞刮下，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。取开始时收集的原培养液，倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。弃上清，加入4mlPBS并轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次，用枪吸干上清后，加100μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min。将裂解液与培养板中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清装于离心管中置于-20℃保存。测定5μl样品中含有的蛋白量，随后取含50μg的蛋白溶液，用电泳仪进行SDS凝胶电泳，让蛋白分离，然后将分离好的PAGE胶转移至PVDF膜上，用封闭液1.5h，在4℃条件下加入兔抗人B蛋白多克隆抗体（1：500）孵育过夜，再置入加入HRP标记的羊抗小鼠IgG（1：5000），每平方厘米膜加0.1ml，封好塑料袋，在室温下轻轻震荡1h，将配好的发光液均匀滴在PVDF膜上，在GelDo