实验设计_奚水君_13301050208.docx

细胞与医学遗传学实验设计 奚水君PAGE 1 细胞与医学遗传学实验设计 奚水君实验设计内容和要求： 已知：（1）A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用；（2）心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变 试通过设计细胞生物学实验明确（1）B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系？（2）在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中？ 目的　研究B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系并探讨B基因的表达产物是否参与A药物保护心肌细胞免受缺血损伤的过程。 方法 用原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞作为材料，缺糖缺氧处理3 h造成缺血损伤，采用CCK-8法测定A药物对缺血心肌的保护作用，使用相关测定试剂或者测定试剂盒测定B基因表达产物在缺血心肌细胞和受A药物保护的缺血损伤心肌细胞中的表达量。 结果 未知。 结论 未知。 1 材料与方法 动物 出生后1～3 d的Wistar或SD大鼠。 药品与药剂 胰蛋白酶和胶原酶；小牛血清；DMEM/F-12培养基；5-溴脱氧核苷；A药物；B基因表达产物相关测定试剂或者测定试剂盒；CCK-8工作液。 仪器 96孔细胞培养板；酶标仪；二氧化碳培养箱；离心机；热磁力搅拌器。 原代大鼠乳鼠心肌细胞培养及缺血处理[1] 取1～3日龄大鼠乳鼠10只，用大头针将乳鼠的头和四肢固定，用75%酒精棉球消毒胸、腹部皮肤；剪开皮肤，暴露皮下组织，更换手术器械，在大鼠剑突处横剪，于剑突处正中线稍偏左处向上剪，成倒T型，在心脏跳动下用眼科镊迅速夹取心脏放入盛有用冰预冷的PBS液体的平皿中；洗去血凝块和红细胞，用眼科镊将心脏包膜和附着的血管分离干净，剪去心房组织，取心室肌放入青霉素瓶，洗去残血后将心室肌剪成碎块（约1 mm3）；用PBS再次清洗血污，加入10～15mL 0.125%胰酶（含0.02%的EDTA），热磁力搅拌器搅拌预热到37 ℃（搅拌速度60～100 r/min），消化8 min；弃上清液，再次加入胰酶继续消化剩余组织，重复消化直至碎片几乎完全消化；分别收集各次消化后的上层细胞悬液置于冰上，经200目不锈钢网过滤以去除未消化的组织及细胞团，并马上加等量的10%血清培养液以终止反应，1500 r/min离心8 min；弃上清液，加入1 mL血清培养液，吹散沉淀细胞，再次离心（1 500 r/min离心8 min）；弃上清液，用10%血清培养液制成细胞悬液，按差速贴壁分离法纯化心肌细胞，以5×105 个/L接种于培养瓶中，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养1.5 h；此后每2 d换液1次；加入终浓度为0.1 mmol/L 5-溴脱氧核苷以抑制成纤维细胞的增殖。 实验分组 共4组，分别为正常对照组（A）、缺血对照组（B）、A药物+正常对照组（C）、A药物+缺血实验组（D）。B、D两组进行心肌细胞缺氧损伤模型的建立，C、D两组培养时同时加入等量且适量的药物A。各组在37 ℃下静置3 h[2]。 心肌细胞缺氧损伤模型的建立[3] B、D两组取培养4 d的心肌细胞，换无血清DMEM/F-12培养基连续培养12 h后，用含有药物的无糖D-Hanks液［预先充入95%氮气（N2）-5%二氧化碳（CO2）混合气饱和30min］替代给药组的培养基，而后迅速将模型组和给药组移入95% N2-5% CO2混合气平衡过的单向气流缺氧装置，测氧仪监测排气口氧浓度（＜1％），于37 ℃电热恒温培养箱中培养6 h。所有4组用含10%胎牛血清的DMEM/F-12 培养基替代正常组的培养基，并移入37 ℃、5%CO2培养箱中培养6 h。 CCK-8法测定细胞活力 接种各组细胞于96孔板中，每组15孔，每孔加110ul CCK-8工作液，继续培养1 h，用酶标仪在450 nm波长处比色，测定吸光度。 测定B基因表达产物 使用试剂或试剂盒分别测定4组细胞B基因的表达产物B蛋白含量。可以使用免疫组织化学的方法等。 可能结果讨论 2.1 B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系？ 如果测定A组、B组的B基因表达产物B蛋白的含量不同，则验证了心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变。如果B组B蛋白含量增加，则说明心肌细胞缺血会导致B基因的激活，其表达产物增加，反之则减少。 2.2 在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中？ 如果B、D组的B基因表达产物B蛋白含量不同，且A、C组的B基因表达产物B蛋白含量也不用，则说明B基因表达产物B蛋白参与A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程；如果B、D组的B基因表达产物B蛋白含量相同，且A、C组的B基因表达产物B蛋白含量也相同，则说明B基因表达产物B蛋白不参与A药物保护心肌细