普通遗传学第十二章 基因工程.pptVIP

第 十二章 基因工程;遗传工程（genetic engineering），也称生物工程，是指：利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手段。 细胞工程（cell engineering） 基因工程（gene engineering） 酶工程（enzyme engineering） 发酵工程（fermentation engineering）;基因工程（gene engineering） 利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。 基因工程操作的对象是DNA分子，首先把目标基因克隆出来插入到一定的载体中，然后将重组DNA分子导入到受体细胞，并使其保持和遗传下去。 ;目的基因的获得 目的基因与载体连接成重组DNA分子 重组DNA分子导入受体细胞 筛选重组克隆 基因表达与产物分离;第 2节 基因的分离;第 2节 基因的分离;（一）限制性内切核酸酶;★限制酶可分为3类。;;;;;;第 2节 基因的分离;（四）聚合酶链式反应(PCR) ;The Polymerase Chain Reaction (animations) ; PCR产物可以通过电泳检测;第 2节 基因的分离;二 载体 ;（一） 质粒 ;（一） 质粒 ;筛选的原理是：细菌细胞含有野生质粒，在含有X-gal（5-溴-氯吲哚-半乳糖苷酶）的培养基上培养时产生兰色菌斑；插入克隆片段后，lacZ基因失去功能，不能代谢X-gal，从而产生白色菌斑。;（二） 病毒载体;（二） 病毒载体;(三 ) 克隆大片段载体;与噬菌体载体和质粒载体相比具有多个优点： 具有cos位点，能高效地转化大肠杆菌，能在大肠杆菌中实现自身环化，并能在大肠杆菌中复制； 有像质粒一样的选择标记； cosmid载体比较小，但能插入较大的外源片段，可克隆外源片段的长度在15~45 kb之间。 由于cosmid载体的大片段克隆能力，多用于基因组文库的构建。已有多种粘粒载体可用于基因克隆，pJB8是最常用的粘粒载体之一;细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC） ;酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome，YAC）;三 基因分离方法;1 构建基因库 基因库(library)是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库。只有利用合乎要求的基因库才有可能筛选出所需要的基因，很多分子遗传学工作才能继续深入下去。 ;核基因库 ◆核基因库(genomic library或genomic bank)是将某一生物的全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。 ◆通常的方法是，尽量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度(大于15kb)的DNA片段，与适宜的载体连接构成重组DNA分子, 选择相应的宿主细胞用于克隆。载体可以是质粒，噬菌体，BAC或YAC等 ;染色体基因库 ;cDNA库 ;◆ cDNA库仅具有用于分离mRNA的细胞或组织内表达的基因的mRNA序列，仅包括基因组的部分基因序列。 ◆构建什么样的基因库取决于研究目的。cDNA 库对于研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的。如分离在某一细胞或组织高效表达的某种基因。 ◆通常是将cDNA库与核基因库配合使用，以便既能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。 ;2 筛选基因库 ;菌落杂交技术寻找目标DNA克隆;从文库中筛选获得目标克隆后，只有进行测序才能进行生物信息分析和功能预测。;（二）T-DNA标签克隆基因;T-DNA 载体构建 ↓转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子 ↓筛选T2，获突变子，应为3:1分离 ↓确定T-DNA与突变型共分离的个体 ↓产生纯合后代 ↓克隆T-DNA两侧的植物DNA ↓利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因 ↓基因功能的验证;（三）基于PCR的基因克隆;（四） 人工合成基因 ;第三节 外源基因的导入 一、农杆菌介导的遗传转化 二 、基因枪法 ;需要具备如下条件： 高效的植株再生体系。选择容易从体细胞再生植株的受体基因型是获得转化成功的关键。 受体植物细胞对农杆菌要有很高的亲和力。一般认为受体细胞应处于高度的分裂状态，T-DNA才能插入植物基因组； 具有有效的选择系统。必须有一个理想的选择方法将转化细胞从非转化细胞中选择出来； 稳定的转化技术和基因表达。外源基因转入植物后应能传代并稳定表达。;◆ Ti质粒是一种细菌质粒，它自然存在