重组hS100A6蛋白的原核表达及其对人骨肉瘤细胞系143B的生物学作用.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（１２）：１７ 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 檪 研究报告 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 重组ｈＳ１００Ａ６蛋白的原核表达及其对人骨肉瘤 细胞系１４３Ｂ的生物学作用 邹正渝　王海燕　黎玉叶　孙双双　叶立伟　武　睿　段　亮　陈　娴　罗进勇　周　兰 （重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室　重庆　４０００１６） 摘要　目的：制备重组ｈＳ１００Ａ６蛋白，并研究其对人骨肉瘤细胞系１４３Ｂ的生物学作用。方法：构 建ｐＧＳＴＨＲＶ３ＣｈＳ１００Ａ６质粒，经转化至 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１，ＩＰＴＧ诱导表达融合蛋白ＧＳＴＨＲＶ３Ｃ ｈＳ１００Ａ６，经超声破菌，谷胱甘肽琼脂糖４Ｂ球珠纯化，ＧＳＴＨＲＶ３Ｃ酶切，再纯化，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴 定，分光光度法蛋白定量。以人骨肉瘤细胞系１４３Ｂ为研究对象，ＭＴＴ检测细胞增殖，Ｈｏｅｃｈｓｔ检 测细胞凋亡，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ检测细胞迁移和侵袭，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｈＳ１００Ａ６对 ｃａｔｅｎｉｎ表达的影响。 β 结果：成功制备重组ｈＳ１００Ａ６蛋白，测得该蛋白产量约为４ｍｇ／Ｌ菌液。３０ｇ／ｍｌ重组ｈＳ１００Ａ６促 μ 进１４３Ｂ细胞的增殖、迁移、侵袭以及 ｃａｔｅｎｉｎ的表达（Ｐ＜０．０５），对１４３Ｂ细胞的凋亡无明显影 β 响（Ｐ＞０．０５）。结论：成功制备重组ｈＳ１００Ａ６蛋白，３０ｇ／ｍｌ重组ｈＳ１００Ａ６蛋白对１４３Ｂ细胞有一 μ 定的促进作用。 关键词　ｈＳ１００Ａ６蛋白　制备　骨肉瘤 中图分类号　Ｑ８１９ ［４］ 　　骨肉瘤是发病率仅次于软骨肉瘤骨恶性肿瘤，好 量的文献报道Ｓ１００Ａ６在多种肿瘤中如卵巢癌 、乳腺 发于青少年，恶性程度高，容易早期引起肺转移，预后 ［５］ 癌 等表达异常，其作用尚存争议。有文献报道在骨肉 差。目前外科手术辅以化疗、放疗成为治疗骨肉瘤的 瘤中Ｓ１００Ａ６高表达，但是其作用却不清楚。本研究拟采 常规治疗方法，但是截肢率高、患者痛苦且疗效不高， 用重组 ｈＳ１００Ａ６处理人骨肉瘤细胞 １４３Ｂ，探讨重组 因此如何能早期诊断及早期治疗该病成为治疗该病、 ｈＳ１００Ａ６对１４３Ｂ细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。 减少患者痛苦的关键。 １　材料与方法 　　Ｓ１００蛋白是一类具有ＥＦ手型结构的小分子钙调 蛋白，该家族目前报道发现至少有２５个成员，其中２１ １．１　细胞和试剂 个成员的基因定位在稳定性较差的人染色体 １ｑ２１上， 　　Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１为本实验室保存菌株，人骨肉瘤细胞 该区染色体易发生染色体重排，与肿瘤关系较为密切。 系１４３Ｂ、ｐＧＳＴｍｏｌｕｃ、ｐＨＡＨＡｈＳ１００Ａ６质粒由美国芝 Ｓ１００Ａ６也称钙周期蛋白（ｃａｌｃｙｃｌｉｎ），是 Ｓ１００钙结合蛋 加哥大学医学中心分子肿瘤研究室馈赠，ＰＣＲ引物合 白家族成员之一，Ｓ１００Ａ６广泛存在于细胞内，在功能上 成、普通 ＰＣＲ、高保真 ＰＣＲ、限制性内切酶 ＸｈｏＩ和 ［１］ ＥｃｏＲＩ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自ＴａＫａＲａ公司，胶回收、ＤＮＡ 具有多种生物学特性，如调节胞内的钙稳态 ，调节蛋 ［２］ ［３］ 纯化及质粒小提试剂盒购自Ｏｍｅｇａ公司，ＩＰ