第六讲DNA文库构建.ppt

基因组文库和cDNA文库的构建 第一节 基因组文库的构建 1 基因组文库(genomielibrary): 将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。 作用：获得特定基因。 2 基因组文库的类型 根据所选用的载体可以分为： 质粒文库 噬菌体文库 黏粒文库 人工染色体文库 3 构建基因组文库应满足的条件 3.1 文库的完整性 要包含基因组的完整序列信息，通过产生一系列一定大小、覆盖全基因组的DNA片段的重组克隆来实现。 3.2 基因组信息的可重建性 通过建立叠连群(contig)重建完整序列信息。 3.3 文库的大小 即文库中应包含的独立重组子数。 一般来说，DNA片段长，完整基因组文库所含的克隆数越少。反之，越多。 基因组越大，文库应包含的克隆数越多，反之，越少。 4 基因组文库的质量标准 一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆； 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序； 克隆片段易于从载体分子上完整卸下； 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。 5 基因组DNA文库构建的程序 (噬菌体基因组文库的构建) ⑴基因组DNA的分离制备 不同来源的DNA制备方法不同。 一般来说，有液相法和固相法两种。 液相法提取的DNA长度一般在100kb左右，基本可以满足构建各种小插入片段基因组文库的要求。 大相对分子质量(high molecular weight,HMW)基因组DNA的提取方法 ⑵基因组DNA的片段化 ①酶切 部分酶切的主要目的是产生随机性的DNA片段用于构建基因组文库。 ②DNA分子的物理剪切 DNA溶液的小孔喷射 超声波处理 高速搅拌 ⑶载体的制备 要求： 载体的去磷酸化处理 载体的纯度 ⑷重组连接 按照连接酶催化反应的最适条件设置反应体系，同时还应通过预备性实验确立反应体系具体的参数。 ⑸噬菌体离体包装 ⑹重组噬菌体感染大肠杆菌 6 基因组文库的扩增筛选 ⑴文库的扩增 基于噬菌体载体的基因组文库通过感染大肠杆菌，重组噬菌体在受体细胞中复制增殖并形成噬菌斑以实现增殖。 风险：在进行文库扩增时，很难保证重组分子均等增殖。所以造成有些克隆丢失，有的增加，有的减少。 ⑵文库的筛选 噬菌斑原位杂交 PCR文库筛选 第二节 cDNA文库构建 高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。 1 概念 cDNA文库： 将生物特定的组织器官或特定时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。 2 cDNA文库优点 ⑴ cDNA克隆以mRNA为材料，特别适合某些病毒基因组结构研究及有关基因的克隆分离。 ⑵ cDNA文库的筛选比较简单易行。 ⑶ 每一个cDNA克隆对应一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性的杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因序列。 ⑷可以在原核中表达。 3 对cDNA文库质量评价 3.1文库的代表性 文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性。 3.2 重组cDNA片段的序列完整性。 4 cDNA文库构建的步骤 ⑴ 分离mRNA； ⑵ 富集mRNA； ⑶ cDNA的合成； ⑷ 黏性末端片段与载体的连接； ⑸ 离体包装获得重组噬菌体； ⑹ 检测重组噬菌体效价。 4.1 细胞总RNA的提取和mRNA的分离 4.2 cDNA第一链的合成 ① oligo(dT)引导的DNA合成法 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。 ②随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis)