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蛋白表达纯化实验步骤(待改进)
1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.
4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、
Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM
到1m M。3
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