实验六及七 动物肝组织中总DNA的提取与定量.ppt

* DNA： OD260/OD28大约等于1.8， 如果大于1.9,表明有RNA污染；小于1.6，表明有蛋白质、酚等污染； * 由十个以上单糖通过糖苷键连接而成的碳水化合物称为“多糖”。 多糖通常是由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖等聚合而成。 * 糖类在强无机酸中为特有的脱水反应生成醛类，它们和各种酚类缩合产生特有的有色物质，因此常用硫酸苯酚法（较为稳定）和硫酸蒽酮法（稳定性较差）作为多糖的含量测量方法。 不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。 * * 在作标准曲线大部分都是用葡萄糖来做标准品，而不是用葡聚糖（MW500，000），因为葡聚糖标准品在国内难于获得且价格昂贵。 正常的反应溶液是深棕色。糖越多颜色越深。注意硫酸的纯度。空白的颜色很深，说明你的空白中的苯酚被氧化了。深红是醌（苯酚氧化生成）的颜色颜色过深的话说明你的酚的浓度过大，一般是5%但是没遇到你说的那么严重，不是深红色的做的好的时候颜色很浅，颜色深点也有可能 * 在作标准曲线大部分都是用葡萄糖来做标准品，而不是用葡聚糖（MW500，000），因为葡聚糖标准品在国内难于获得且价格昂贵。 正常的反应溶液是深棕色。糖越多颜色越深。注意硫酸的纯度。空白的颜色很深，说明你的空白中的苯酚被氧化了。深红是醌（苯酚氧化生成）的颜色颜色过深的话说明你的酚的浓度过大，一般是5%但是没遇到你说的那么严重，不是深红色的做的好的时候颜色很浅，颜色深点也有可能 * * * * 动物肝组织中总DNA的提取与定量 一.实验目的 掌握DNA提取的主要方法及原理 掌握提取得到的DNA的质量鉴定及定量方法 分离提取目的：总DNA的提取；特异DNA的分离提取；质粒DNA的分离提取。 总DNA 的提取： 利用DNA与RNA、蛋白质的不同性质进行 特异DNA的分离提取： Chromatography色谱层析法，Electrophoresis电泳法，Ultracentrifugation超滤法 二.实验原理 DNA的提取分离 保证核酸一级结构的完整性 尽量降低其他生物大分子的污染 避免高浓度有机溶剂和金属离子 尽量去除其他核酸分子 二.实验原理 DNA提取的原则 常见的标本：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 －80℃或液氮 二.实验原理 DNA样品的准备 苯酚-氯仿抽提法 甲酰胺解聚法 玻璃棒缠绕法 异丙醇沉淀法 表面活性剂快速制备法 二.实验原理 DNA提取常见方法 破碎细胞 提取 纯化 I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 ? V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 预习思考题 DNA提取一般步骤及主要目的 肝组织匀浆液 GA缓冲液 蛋白酶K GB缓冲液 裂解细胞并水解蛋白质 无水乙醇 沉淀核酸 将溶液及絮状沉淀转移至DNA纯化柱 蛋白清洗液GD 核酸被硅基质膜吸附 洗涤液PW 洗脱液TE 上清 滤液 滤液 纯化柱移至新2mL的EP管中 基因组DNA 小鼠肝脏组织液(100 μl )于10,000rpm 离心1 分钟 ，倒尽上清，加200 μL 缓冲液GA，振荡至彻底悬浮； 加入20 μL 蛋白酶K，振荡混匀，于56 ℃水浴放置15分钟； 加入200 μL 缓冲液GB，颠倒离心管充分混匀； 置于70℃水浴10 min； 加入200 μL 无水乙醇，剧烈振荡混匀15秒； 将吸附柱CB3装在收集管上，然后将所得溶液及沉淀都转移至吸附柱中。12000 rpm 离心30秒，倒掉收集管中的滤液。 加入500 μL 蛋白清洗液GD，12000 rpm离心30秒，倒掉收集管中滤液； 加入500 μL 洗涤液PW，12000 rpm离心30秒，倒掉收集管中滤液； 重复步骤8； 12000 rpm离心2分钟，去掉收集管，把吸附柱放入1.5mL EP管中，打开盖子放置5-10分钟； 加入100 μL 洗脱液TE，室温放置5分钟，12000 rpm离心2分钟; 离心所得的洗脱液转入5 mL EP管中并加入2 mL 水，分别检测260 nm和280 nm处的紫外吸光度，计算提取得到DNA的质量和纯度。 实验操作 试剂使用说明 本实验使用TIANGEN的基因组DNA提取试剂盒 GA：细胞裂解液，裂解细胞； 蛋白水解酶K：水解蛋白质； GB：高盐缓冲液，增强DNA与离心吸附柱的结合； GD、PW：含一定量乙醇的漂洗液； TE：低盐的洗脱缓冲，溶解吸附柱上的DNA，本实验由于需要进行吸光度值测量，分配的TE溶液实际使用了水