实验六细胞骨架观察.ppt

细胞生物学实验 细胞骨架的观察 细胞生物学实验 掌握细胞骨架的观察方法及原理. 了解光学显微镜下细胞骨架的基本结构 实验目的 实验原理 细胞骨架是细胞中由蛋白质丝组成的非膜结构系统，由微管(24～25nm)、微丝(5～7nm)和中间纤维(8～11nm)组成。 Triton X是一种非离子型的表面活性剂。 动植物细胞用适当浓度的Triton X-100处理后，可将细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质却保护完好。 考马斯亮蓝R250(Coomassie brilliant blue R250)是一种蛋白质染料。 处理后的材料用考马斯亮蓝R250染色后，用光学显微镜观察，可以见到一种网状或平行丝状结构，即是细胞骨架结构。 实验用品 实验材料 洋葱鳞叶 体外培养小鼠胎儿成纤维细胞 实验用品 实验试剂 0.2mol/L磷酸缓冲液(PBS)，pH 6.8 M缓冲液，pH 7.2 1%Trion X-100：用M缓冲液配制 3%戊二醛：用磷酸缓冲液配制 0.2％考马斯亮蓝R250染色液 中性树胶 实验仪器：显微镜，烧杯，镊子,玻璃滴管等 实验中各种试剂的作用 M缓冲液:稳定细胞骨架 咪唑是缓冲剂 巯基乙醇抗氧化 EGTA(乙二醇-双-(2-氨基乙基)醚四乙酸),EDTA(乙二胺四乙酸)螯合Ca2+ 氯化镁,提供Mg2+,在低钙条件下,骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张 M-缓冲液的组成（单位：mmol/L）: 咪唑50；KCl50 ;MgCl2 0.5;EGTA 1.0; EDTA 0.1;B-巯基乙醇1.0;甘油4.0 G-actin Mg2+、高K+、Na+ 诱导 含ATP、Ca2+、低K+、Na+ F-actin G-actin：球形肌动蛋白 F-actin: 纤维肌动蛋白 戊二醛固定细胞结构 是一种双交联剂,渗透快,交联能力强,对蛋白质的固定效果好,且不破坏细胞骨架的结构。 考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝 实验内容 洋葱鳞茎内表皮细胞骨架(微丝)的观察 小鼠胎儿成纤维细胞微丝束(张力纤维)的观察 1.洋葱鳞茎内表皮细胞骨架(微丝)的观察 取材(内表皮约5*5mm2,3-5片) PBS洗3次,每次3min 吸去PBS，加1％Triton X-100 处理20-25min 吸去Triton X-100 ,用M缓冲液洗3 次,最后一次5min 吸去M缓冲液,用3％戊二醛固定15min PBS洗3次,每次5min 0.2%考马斯亮蓝R250染色15min 蒸馏水洗2次(去浮色) 装片,光学显微镜观察(10×/40×) 或自然干燥→二甲苯透明→树胶封片 实验步骤 2.小鼠胎儿成纤维细胞微丝束(张力纤维)的观察 取出细胞爬片(培养在载玻片上,生长密度达一定程度的小鼠成纤维细胞),放培养皿中用PBS轻轻冲洗2～3次,每次3min 吸去PBS,加1％Triton X-100 处理25-30min 吸去Triton X-100 ,用M缓冲液轻轻洗3 次,最后一次5min 吸去M缓冲液,用3％戊二醛固定15min PBS洗3次,每次5min 0.2%考马斯亮蓝R250染片20min 蒸馏水漂洗2次(去浮色) 室温下自然干燥后细胞爬片置于载玻片上(有细胞面朝上) 镜检(在光学显微镜下先10×再40×观察),合格者可用树脂封片 实验结果 洋葱鳞茎内表皮细胞(示细胞骨架) 小鼠胎儿成纤维细胞张力纤维 Triton X-100处理是成功的关键 夹取细胞爬片时候要小心，注意反正面，有细胞面朝上 在培养皿里处理比较方便，避免来回夹取 洗的时候加处理液(如PBS)不要太冲，不要把细胞冲下来。可稍多加点,并稍晃动到时间再吸掉(或倒掉) 洋葱鳞茎内表皮取材不宜过大,以防卷曲 注意事项 思考题 1.细胞骨架主要有哪几类？主要成分是什么？ 2.秋水仙素,细胞松驰素等对细胞骨架有何影响? 实验报告 选择效果最好的装片,贴上姓名标签,作为本次实验作业上交. * * * 细胞生物学实验 * * *