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微生物代谢组学及其应用的研究进展 朱来宽1,2　综述; 梁景平1　审校2010-6-14 12:36:24 [摘　要]　　代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后系统生物学中形成的另一重要组成部分,也是目前组学领域研究的热点之一。代谢组学技术对理解细胞功能来讲是一种十分重要的功能基因组学技术,因为代谢组直接反应了细胞的生理状态,利用代谢组学技术很有可能去发现细胞新的生化途径并解释其正常的或病理的功能。该文就代谢组学所涉及的技术及其在微生物领域的应用进行综述。[关键词] 代谢组;代谢组学;微生物 代谢活动是生命活动的本质特征和物质基础。代谢组[1](Metabolome)是指某一组织或细胞在一特定生理时期内所有低分子量的代谢产物。代谢组学(Metabolomics)是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后系统生物学的另一重要组成部分,也是目前组学领域研究的热点之一。细胞内的生命活动大多发生于代谢层面,如细胞信号释放、能量传递、细胞间通信等,代谢产物是基因表达的最终产物,基因和蛋白表达的微小变化可以在代谢物上得到放大,因此代谢组学技术对理解细胞功能来讲是一种十分重要的功能基因组学技术,因为代谢组直接反应了细胞的生理状态[2],利用代谢组学技术很有可能去发现细胞新的生化途径并解释其正常的或病理的功能[3]。代谢组学技术在微生物研究中的技术路线一般为:生物标本采集→数据获取→数据分析。本文对该路线中所涉及的方法及其在微生物中的应用进行一综述。1　生物标本采集 研究特定条件下培养的细菌的代谢组,首先要对菌体样品进行采集,采集菌体细胞内的代谢产物先要终止其代谢过程即淬火(quenching),然后提?1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.取(extraction)胞内代谢产物。1.1　淬火 淬火的方法一般有:①用超滤性膜快速过滤后立即冰冻细胞[4];②用高氯酸稀释细胞[5];③在-45℃甲醇溶液中稀释细胞[6];④培养基置入液氮快速冷冻、解冻、离心收集细胞[7];⑤用带有预冷的不锈钢珠的注射器迅速取样、过滤收集细胞[7]。在这些方法中,甲醇淬火液易导致严重的代谢物渗漏,不适用于精确测定细胞内代谢产物的水平;而快速过滤则能获得高水平的代谢产物、氨基酸并阻止三羧酸循环中间产物的逆转,能很好地反映细胞内代谢产物的水平[8];Mashego等[7]报道:用液氮快速冷冻的方法定量分析代谢产物亦不可靠,而用带有预冷的不锈钢珠的注射器迅速取样、过滤收集细胞的方法相对比较适合定量分析代谢产物。1.2　提取 代谢组学的分析需要通过特定的试剂把某一组织或细胞在一特定生理时期内所有低分子量的代谢产物提取(extraction)出来。最佳的提取方法应该包括以下几点[9]:①最大限度地提取代谢产物;②对有特殊物理或化学特性的分子无特异性和吸附性;③不通过物理或化学方式破坏或修饰代谢产物。 目前提取细胞内代谢产物的方法有:①在乙醇缓冲液中煮沸细胞随后在旋转蒸发器中脱水[10];②用高氯酸提取[5];③-45℃甲醇提取[6]。高氯酸提取容易导致大多数代谢产物量的减少或缺失[11],而冷的甲醇可以同时用来进行淬火和提取胞内代谢产物,且不导致有挥发性的代谢产物如丙酮酸蒸发掉,是首选的提取方法[12]。但是Rabinowi tz等[13]最近研究发现冷的甲醇-水(50∶50)液能使三磷酸核苷酸显著降解,导致三磷酸的丢失从而引起磷酸化的核苷酸衍生物(如磷酸盐、核苷、碱基)的丢失,影响对代谢组的研究,进而错估细胞内的能荷;实验中发现酸性乙腈液能使三磷酸根的降解达到最小,减少高能代谢物的丢失及其向低能衍生物的转化,从而提高代谢物的提取量,因此乙腈-甲醇-水-液是提取代谢物的首选。 适当的取样是代谢组学技术精确和有效的关键,通常的取样技术能引起细胞内代谢产物水平出现误差。抑制代谢物渗漏的影响、减少取样时间的影响、数据的有效性检查均需进一步改进。不同取样方法联用是覆盖微生物细胞内代谢物范围的最佳方法。2　数据获取 在细胞内代谢产物提取后紧接着就是如何对这些提取物进行分辨、鉴定和定量分析以获取原始数据。酶分析法虽然特异性高,但是其所需样品体积多,而且一次只能分析一种物质。随着色谱技术和质谱技术的发展,从小体积样品中同时分析多种代谢产物成为了可能。目前应用比较多的方法有以下几种[14]。2.1　气相色谱-质谱在代谢组学中的应用 气相色谱-质谱(Gas chromatography coupledto mass spectrometry,GC-MS )在代谢组学研究中是很