高级生物化学-第五节 蛋白质的理化性质.ppt

1. 高压：由于HPLC是以液体作为流动相，而液体比气体通过色谱柱时所受的阻力要大得多 ，所以必须施加高压，一般为15-30MPa，最高可达50MPa。 2. 高速：由于HPLC采用了高压，使流动相液体的流速加快，一般分析周期为数分钟至数10分钟，比经典的液相柱色谱要快得多，但比GC稍慢。 3. 高效：由于HPLC的柱效较高(每米塔板数可达5000)，有时一根柱子可分离数十种乃至上百种组分。 4. 高灵敏度：采用灵敏的检测器和自动化装置，可检出10-9g乃至10-11g 的物质；所需试样量很少，通常只需数十微升试样即可进行全分析。 由于HPLC具有以上特点，所以70年代以来得到了迅速的发展。一般认为，对于有机物的色谱分析，当其相对分子质量小、沸点较低时，可用GC进行分析；沸点较高(＞450 ℃)、不能气化或热稳定性差者，可用HPLC分析；如果条件不允许，无法购置昂贵的仪器时，可用TLC等经典液相色谱进行分析。 高效液相层析和快速蛋白液相层析 六、 蛋白质含量分析和纯度鉴定 （一）? 含量的测定 1. 凯氏定氮法： 2. 双缩脲法 3.紫外线吸收法 4.福林—酚试剂法 紫外吸收法的优缺点： 优点：简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中(特别是在柱层析分离中)广泛应用。 缺点： (1) 对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差， (2) 若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。 4.福林—酚试剂法： a 福林—酚试剂包括两组试剂：碱性铜试剂和磷钼 酸和磷钨酸的混合试剂 b 碱性铜试剂与蛋白质产生双缩脲反应 c 反应后的蛋白质的酚基在碱性条件将磷钼酸和磷 钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝，蓝色的深浅与蛋 白含量质成正比(在650nm比色测定)。 五种蛋白质测定方法比较如下： 650nm 560nm （二）??? 蛋白质纯度的鉴定 蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法： （1）电泳：目前采用的电泳分析有等电聚集、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS—PAGE、毛细管电泳等。纯的蛋白质在一系列不同的pH条件下进行电泳时，都将以单一的速度移动，它的电泳图谱只呈现一个条带(或峰)。 （2）离心沉降：纯的蛋白质在离心场中，应以 单一的沉降速度移动 ??? 蛋白质纯度的鉴定 （3）HPLC：常用于多肽、蛋白质纯度的鉴定。纯蛋白质样品在HPLC的洗脱图谱上呈现出单一的对称峰。 （4）溶解度分析： （5）N—末端分析也用于鉴定纯度，因为均一的单链蛋白质样品中，N端残基只可能有一种氨基酸。 氨基酸及蛋白质理化性质的鉴别 测定蛋白质分子相对质量的方法小结 沉淀蛋白质的方法 蛋白质的纯化分离（1） 蛋白质的纯化分离（2） 反应名称 试 剂 颜 色 有关基团 范 围 米伦反应 HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物 红色 Tyr 黄色反应 浓HNO3及NH3 黄色、橘色 Tyr、Phe 乙醛酸反应 (Hopking-Cole反应) 乙醛酸试剂及浓H2SO4 紫色 Trp 蛋白质的颜色反应 蛋白质的颜色反应 反应名称 试 剂 颜 色 有关基团 范 围 茚三酮反应 茚三酮 蓝色 自由氨基及羧基 α-氨基酸 坂口反应 (Sakaguchi反应) α-萘酚、NaClO 红色 胍基 Arg 酚试剂反应 (Folin-Cioculteu反应) 碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸 蓝色 酚基 Tyr 双缩脲反应 NaOH、CuSO2 紫色或粉红色 二个以上肽键 所有蛋白质 思 考 题 思 考 题 思 考 题 3．一个蛋白质混合物含有下面几种不同的组分：  a、 Mr＝12，000 pI=10； b 、 Mr=62，000 pI=4 c 、 Mr＝28，000 pI=7； d、 Mr=9，000 pI＝5  不考虑其他因素，分别指出在下述情况下被洗脱的顺序。 ① 该混合物用DEAE-纤维素柱层折时，以逐渐增高洗脱液的盐浓度方式进行洗脱。 ② 该混合物用SephadexG-50凝胶柱层