真核细胞基因组DNA制备14检本.ppt

实验须知 地中海贫血 地中海贫血(Thalassemia):又称海洋性贫血，是一种常见的单基因遗传性溶血性血液疾病。 广泛分布在全世界沿海地区。 中国常见于东南沿海、西南 地区 病因探究找到方法 地中海贫血 α点突变/缺失 β地中海贫血基因 轻型β－地中海贫血、 中间型β－地中海贫血、 重型－β地中海贫血 遗传性胎儿血红蛋白持续症 α地中海贫血基因 静止型、 标准型、 HbH病、 Bart’s胎儿水肿综合征 β点突变 * α-地中海贫血基因诊断操作流程 β-地中海贫血基因诊断操作流程 真核细胞基因组DNA的分离与纯化 真核细胞基因组DNA的提取与纯化 1.实验目的 1、掌握提取真核细胞基因组DNA的原理。 2、熟悉提取真核细胞基因组DNA的操作步骤。 3、了解真核细胞基因组DNA 在分子生物学中的作用与意义 一、基本原理 1.DNA属于极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，其钠盐比游离形式更易溶于水，并呈粘性胶体状态，在酸性溶液中易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定（PH8.0）； 2.在高盐的状态下，DNA吸附树脂专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。 基因组抽提 加入吸附柱 缓冲液漂洗 DNA洗脱收集 样本裂解 二、实验材料与器材 1.人全血及基因组DNA提取试剂盒； 2.台式高速离心机、水浴恒温箱、移液枪、塑料离心管等； 实验步骤 在EP管中进行 1. 裂解细胞：取全血200μl至离心管中.(加入300 μl溶液细胞裂解液CL，温和地上下翻 转6-8次使细胞充分裂解， 10000 rpm 离心1 min ，吸去上清，留下细胞核沉淀，向离心管沉淀中加入200ulGS，震荡至彻底混匀。) 2.去蛋白：加入20 μl蛋白酶K,并混匀； 3.溶解DNA：加入200μl缓冲液GB,充分颠倒混匀后，56℃放置10min，其间颠倒混匀数 次，溶液应变清亮；室温放置3min。 4. 沉淀DNA：加入350 μl缓冲液BD，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀； 吸附柱中进行 5. DNA纯化：将4步所得溶液和絮状沉淀全部加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3重新放入收集管中； 6. 漂洗DNA： 1）向吸附柱中加入500 μl缓冲液GDB，12000rpm 离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管； 2）向吸附柱中加入600 μl漂洗液PWB,12000rpm 离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管； 3）向吸附柱中加入600 μl漂洗液PWB,12000rpm 离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管； 7.去除漂洗液：将吸附柱放入收集管中, 12,000 rpm 离心2 min，弃废液，将吸附 柱置于室温放置5分钟，彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液。 实验步骤 在新的EP管中进行 . 8.收集纯化DNA：将吸附柱转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加100μl洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管内备用。 琼脂糖凝胶电泳 1、加样：直接从纯化DNA管中取5μl DNA样本+1ul上样缓冲液，混匀，加入电泳孔中，注意不要加到孔外；marker：6ul（视频） 2、电泳：盖上电泳槽，接通电源，开始电泳 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：电压130V；时间30-40分钟左右 电泳操作步骤 五、 结果处理 利用凝胶成像系统进行检测 DNA的保存 提取的DNA作好标记（标注名称，日期），一起保存于冰箱-20℃。(短期可置于4 ℃，长期于-70 ℃分装保存，应避免反复冻融) 四、注意事项 加入乙醇颠倒混匀后可能会出现絮状沉淀，动作要轻柔。 要注意防止污染，开盖要轻柔，防止液体溅出导致气溶胶污染 样品处理管及吸头等实验用品，均需高压灭菌，一次性使用。 思考题 DNA提取量少或者DNA样品不纯的原因可能有哪些? 教学安排 1、实验报告:电子版 2、实验汇报：最后一节课 * 地中海贫血（Thalassemia）于1925年由Cooley和Lee首先描述，最早发现于地中海区域，当时称为地中海贫血，国外亦称海洋性贫血。 我国自然科学名词审定委员会建议本病的名称为珠蛋白生