实验五细胞融合与凝集.ppt

* 静置10 ～ 20min * 温度、融合时间、PEG的浓度与作用时间、细胞密度、机械力等因素均影响融合率，实验操作时应予以注意，并在需要的时候及时镜检。 细胞生物学实验 细胞生物学实验 实验五 实验目的 通过细胞融合的观察 了解细胞融合的原理 掌握用PEG诱导细胞融合的方法 通过细胞的凝集反应的观察 了解细胞膜的表面结构 了解细胞发生凝集反应的原因 学习研究细胞凝集反应的方法 实验原理 细胞融合 细胞融合是指两个或两个以上的细胞合并成为一个具有双核或多核细胞的过程。在自然情况下，体内和体外培养的细胞均能发生自发融合现象; 细胞融合可在自然条件下或利用人工条件 (生物的、物理的、化学的)下进行; 聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用， 从而使细胞发生融合,形成双核或多核细胞 ; 融合的频率和活力与所用PEG的分子质量、浓度、作用时间、反应温度、细胞的生理状态与密度等有关。 通过有丝分裂，细胞核便发生融合，形成杂种细胞。 诱导细胞融合的主要方法 1.生物法 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。 2.化学法 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚乙二醇（PEG）。PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝集；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核融合细胞。???? ?3.物理法 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。 激光诱导的细胞融合：利用短脉冲激光微束的亚微米作用范围、高峰值功率、短作用时间，可以在两样品接触区的质膜层形成亚微米量级的通透性孔径，完成孔径周围磷脂分子的高密度激发重组形成质膜融合。 图2 用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。 图1 细胞在高频交流电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串 PEG 结构式：CH2（OH）-（CH2CH2O）n -CH2OH (n为聚合度) 高分子化合物,分子量根据聚合度的不同而不同, 常温下 平均分子量200～600者为液体 700～2000者为半固体(白色蜡状固体) 4000～6000者为白色粉末状 8000,10000,20000 易溶于水 液体粘度随分子量增加而增加 体细胞杂交 细胞融合又称体细胞杂交 最初两个细胞只有胞浆合在一起，核各自独立 在随后的有丝分裂中，两种细胞的染色体才彼此混合在一起，这时则叫合核体的杂种细胞。 基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体(homokaryon) 来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)。 实验原理 细胞凝集反应 细胞膜的基本成份是膜脂和膜蛋白质，膜脂和膜蛋白又可被糖基化成糖脂和糖蛋白，分枝状的糖基主要位于质膜外侧构成细胞表面的糖外被; 凝集素(Lectin)广泛存在于植物，动物和微生物中，是一类可逆结合特异糖基的蛋白质，能与细胞膜外被的寡糖链相连接，使细胞发生凝集; 一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力 糖被的结构和组成示意图 凝集素的作用机制 常见的凝集素一览表 凝 集 素 缩 写 特异性结合 花生（ Peanut agglutinin） PNA D—半乳糖、Gal(1→3)—GalNAC 刀豆（Concanavalin ensifomis agglutinin） ConA D-葡萄糖、D-甘露糖 蓖麻（Ricinus communis agglutinin） RCA D—半乳糖、D-GalNAC半乳糖 扁豆（Lens cuinaris agglutinin) LCA D-甘露糖、D—葡萄糖 豌豆（Pisum satiwum agglutinin） PSA D-甘露糖 菜豆（Phaseolus vulgaris agglutinin） PHA D-GalNAC 大豆（soybean agglutinin） SBA D-GalNACD-半乳糖 荆豆（Ulex europeaus agglutinin） UEA L-岩藻糖 麦胚(Wheat germ agglutinin) WGA D-GalNAC、 NANA (Bandeiraea simplicifolia aggluti