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PAGE PAGE 6 《生化分析实验讲义》 罗喜牛编 2007学年下半学期[2007.9.8一2008.1.8]同学上课所用讲义 实 验 一 《紫外分光光度法测定蛋白质吸收光谱曲线》 1、实验目的与要求： （1）、了解紫外分光光度仪的基本原理和使用方法。 （2）、学习和掌握紫外吸收光谱曲线的制作方法。 （3）、了解和掌握蛋白质的定性原理。 2、实验原理： 蛋白质所含有的一些芳香族氨基酸（主要是苯丙氨酸，酪氨酸）具有共轭双键结构能够产生π→π﹡及n→π﹡类型的电子跃迁，因此能够在近紫外光区产生光吸收，并且在280 nm波长处有一特征吸收峰。利用这一特性，通过对蛋白质紫外吸收光谱曲线的测定，可以进行定性分析。 3、实验仪器与器材： 3-1、实验仪器：（略） 3-2、实验器材：（略） 4、试剂及配制： 4-1、 牛血清白蛋白标准溶液的配制（1.0 毫克/毫升）： 准确称取牛血清白蛋白标准品50毫克，置于50毫升容量瓶中，先加适量蒸馏水将其溶解，然后补加蒸馏水定容至刻度，混匀后即浓度为1.0 毫克/毫升的溶液。 4-2、 测试的蛋白质样品溶液的配制（1.0 毫克/毫升）： 准确称取测试蛋白质样品50毫克，置于50毫升容量瓶中，先加适量蒸馏水将其溶解，然后补加蒸馏水定容至刻度，混匀后即浓度为1.0 毫克/毫升的溶液。 5、操作步骤： 5-1、蛋白质的紫外吸收光谱曲线的测定： 采用2只光径1.0厘米洁净的石英比色杯，分别倒入蒸馏水4.0毫升和牛血清白蛋白标准品或测试样品溶液4.0毫升于各比色杯中，以蒸馏水为空白溶液，调仪器零点（具体方法详见仪器操作说明书）。标准品或测试样品溶液在250—300 nm波长的范围内，以每间隔5个nm波长依次测定，同时记录各波长蛋白质溶液的吸光值。在每次更换测定波长时均需要重新调节仪器“零点”后，方能测定。对测定波长的范围和间隔大小，可根据不同样品的实际情况和要求加以确定（加大或缩小间隔）。 5-2、蛋白质的紫外吸收光谱曲线的制作： 以测定的波长为横坐标，相对应的吸光度为纵坐标对应作图。然后分别将图中各点用线连起来，即得到蛋白质的紫外吸收光谱曲线，其中最大吸收峰值所对应的波长即为蛋白质最大吸收波长。 6、实验结果： （1）、牛血清白蛋白标准品或测试品溶液在不同波长测定吸光值结果 表1。牛血清白蛋白样品溶液在250—300 nm各波长吸光值结果表 波长（nm） 250.0 255.0 260.0 265.0 270.0 275.0 275.0 吸光度(A) 波长（nm） 277.5 280.0 282.5 285.0 290.0 295.0 300.0 吸光度(A) （2）、牛血清白蛋白的紫外吸收光谱曲线的制作 友情提醒我之见： （1）、需要强调的是：紫外、可见分光光度法测定样品时都需要用一个“空白管”，它主要是用于仪器校“零点”用。空白管一般又习惯称“零管”和“对照管”。 （2）、能作为“零管”溶液的条件？一般要求是：被测定的溶质的溶剂作为零管溶液，但是如果实验本身要求不高或所用溶剂与蒸馏水在某一特定的波长吸光度差异很小（已比较过），也可以直接用蒸馏水甚至自来水代替。 （3）、在特征吸收峰附近波长间隔尽量要小，否则会错过真正的特征吸收峰值。特征吸收峰通常又称最大吸收峰，如蛋白质、核酸分别在280nm和260nm时的吸收值最大。 （4）、在吸收光谱曲线及含量的测定中，要达到结果的准确性，除了自身的操作水平外，还要保证分光光度计的波长精度(除校正外，还有厂质，所以要写仪器型号，厂名)，以及有关测定样品的溶剂，pH,离子强度，温度以及其他相关条件的一致性,否则会给实验结果带来差异，既不一致性。 （5）、一般需要精确定量测定，均需用定量瓶（或称容量瓶）及校准过的量器配制溶液。 实 验 二 《荧光光度法测定核黄素含量》 1、实验目的和要求： （1）、了解荧光法测定核黄素的原理和方法。 （2）、学习荧光光度计的操作和使用。 （3）、掌握荧光定量分析的工作曲线。 2、实验原理： 核黄素（维生素B2）是一种异咯嗪衍生物。在水及乙醇的中性溶液中为黄色，并且有很强的荧光，这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的而氢化物，同时失去荧光，因而样品的荧光背景可以被测定。二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应如下： 核黄素二氢核黄素 核黄素 二氢核黄素 核黄素的激发光波长范围约为440— 500nm(一般规定为440nm),发射光波长范围约为5